一種高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立與應(yīng)用

朱 濤,段 芹,李朝品,瞿 滌

一種高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立與應(yīng)用

朱 濤1,段 芹2,李朝品1,瞿 滌3

目的 建立一種高效構(gòu)建葡萄球菌基因敲除突變株的方法。方法 通過(guò)融合PCR將vraSR操縱子上、下游同源片段連接起來(lái)；通過(guò)基于位點(diǎn)特異性重組的Gateway克隆技術(shù)將融合PCR產(chǎn)物連接入溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKOR1，轉(zhuǎn)化修飾缺陷型大腸桿菌DC10B，獲得同源重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR；電轉(zhuǎn)化表皮葡萄球菌RP62A株；在高溫和氯霉素雙重選擇壓力下，質(zhì)粒通過(guò)第1次同源重組整合到表皮葡萄球菌染色體上；轉(zhuǎn)移到無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)生第2次同源重組；將菌液涂布于含1 μg/mL脫水四環(huán)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行反向篩選，那些未發(fā)生重組的整合菌株因表達(dá)必需基因secY的反義RNA而無(wú)法生存，最后，挑取菌落通過(guò)PCR進(jìn)行鑒定。結(jié)果 成功構(gòu)建了難以轉(zhuǎn)化的表皮葡萄球菌RP62A株的vraSR基因敲除突變株。結(jié)論 利用大腸桿菌DC10B和穿梭質(zhì)粒pKOR1對(duì)葡萄球菌進(jìn)行基因敲除的方法簡(jiǎn)便高效，適用的范圍更廣泛。

基因敲除；葡萄球菌；反向選擇；限制修飾系統(tǒng)

Supported by the Open Research Fund Program of Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Ministry of Education and Health(No.201406),the Research Fund of Anhui Province Key Laboratory of Biological Macro-molecules Research (No.LAB201408),the Key Program of Educational Commission of Anhui Province of China (No .KJ2015A218), and the Provincial Training Program of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates (No.AH201310368111) Corresponding author: Li Chao-pin, Email: cpli001@163.com

應(yīng)用遺傳操作鑒定病原菌毒力因子的原則被Stanley Falkow稱為分子郭霍法則。基本的前提是通過(guò)精確的遺傳操作，使編碼潛在毒力因子的基因失活[1]?；蚯贸菍?shí)現(xiàn)基因失活的重要手段之一。現(xiàn)階段葡萄球菌基因敲除的基本策略是將目的基因上游片段、抗生素抗性基因、下游片段分別連接入大腸桿菌/葡萄球菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建同源重組質(zhì)粒；然后導(dǎo)入限制性缺陷的金黃色葡萄球菌RN4220中進(jìn)行修飾，最后導(dǎo)入目標(biāo)菌株；在溫度和抗生素的雙重選擇壓力下，重組質(zhì)粒與染色體發(fā)生兩次單交換，抗生素抗性基因取代目的基因，突變株最終通過(guò)其對(duì)抗生素的抗性而被篩選出來(lái)[2-3]。

然而，由于同源重組以及質(zhì)粒丟失的幾率都很低，因此突變株的篩選就成為了一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。而pKOR1質(zhì)粒則通過(guò)引入反向選擇改進(jìn)了突變株的篩選工作。該質(zhì)粒在誘導(dǎo)條件下可表達(dá)secY基因的反義RNA，secY是葡萄球菌的必需基因，攜帶或整合了該質(zhì)粒的菌株在篩選時(shí)將無(wú)法生存，因此極大地提高了篩選的效率。另外，由于在質(zhì)粒中引入了重組位點(diǎn)，因此可運(yùn)用Gateway克隆技術(shù)快速構(gòu)建同源重組質(zhì)粒[4]。此外，由于葡萄球菌存在強(qiáng)大的限制修飾系統(tǒng)，因此對(duì)其基因敲除只能集中在少數(shù)可轉(zhuǎn)化的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌實(shí)驗(yàn)室菌株上。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IV型限制修飾系統(tǒng)是阻止質(zhì)粒DNA從大腸桿菌轉(zhuǎn)移至葡萄球菌的主要屏障。IV型限制性內(nèi)切酶識(shí)別胞嘧啶甲基化的DNA序列[5]。Monk等人建立了大腸桿菌克隆菌株DH10B的dcm突變株DC10B，發(fā)現(xiàn)分離自DC10B的質(zhì)粒DNA能夠直接轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌的大多數(shù)克隆復(fù)合體和表皮葡萄球菌[6-7]。

因此，本研究擬采用大腸桿菌DC10B和穿梭質(zhì)粒pKOR1構(gòu)建一株難以轉(zhuǎn)化的表皮葡萄球菌的vraSR基因敲除突變株，vraSR基因編碼的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)在葡萄球菌的耐藥性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[8]，以期建立一種高效的葡萄球菌基因敲除的新方法，為后續(xù)的基因功能研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 表皮葡萄球菌35 984株由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DC10B由復(fù)旦大學(xué)許濤博士惠贈(zèng)，穿梭質(zhì)粒pKOR1由復(fù)旦大學(xué)丁百興博士惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 溶葡萄球菌素(Lysostaphin)、氯霉素、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；脫水四環(huán)素為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×Pfu PCR MasterMix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；BP ClonaseTMII Enzyme Mix購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；引物合成和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TSB( Tryptic Soy Broth) 為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；B2培養(yǎng)基成分為：10 g/L干酪素水解物，25 g/L酵母提取物，25 g /L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀，5 g/L葡萄糖。

1.3 表皮葡萄球菌基因組DNA的提取 將過(guò)夜培養(yǎng)的表皮葡萄球菌RP62A株按1∶100接種于4 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～5 h，取1 mL菌液12 000 g離心收集菌體，重懸于180 μL TE緩沖液，加入20 μL溶葡萄球菌素溶液(1 mg/mL)，37 ℃孵育30 min以使菌體充分裂解(以澄清透明為準(zhǔn))。后續(xù)實(shí)驗(yàn)依照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行，最后基因組DNA溶解于60 μL超純水中(pH7.0)。

1.4vraSR基因上下游同源片段的擴(kuò)增及融合PCR反應(yīng) 基因敲除突變株的構(gòu)建流程和基本原理如圖1所示。以表皮葡萄球菌基因組DNA為模板，以引物vraSR-UF和vraSR-UR擴(kuò)增上游同源片段，以引物vraSR-DF和vraSR-DR擴(kuò)增下游同源片段，切膠回收。具體引物序列見表1，小寫字母為上下游同源片段之間的互補(bǔ)序列，下劃線為attB1和attB2位點(diǎn)。參照李敏等人的文獻(xiàn)[9]，在50 μL的體系中加入等摩爾的上下游同源片段共3 μL(DNA總質(zhì)量約600 ng)，2×Pfu PCR MasterMix 25 μL，超純水18 μL進(jìn)行互補(bǔ)延伸，以形成全長(zhǎng)的融合PCR產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，10 cycles；72 ℃ 10 min。在上述中間產(chǎn)物中加入引物vraSR-UF和vraSR-DR各2 μL，依照下列反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 2 min，30 cycles；72 ℃ 7 min進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增。

1.5 同源重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR的構(gòu)建Gateway克隆 取融合PCR產(chǎn)物4 μL(約300 ng)，pKOR1質(zhì)粒1 μL(約150 ng)，TE緩沖液3 μL，BP ClonaseTMII Enzyme Mix 2 μL，混和均勻后置于25 ℃孵育18 h。加入1 μL 2 μg/μL蛋白酶K，置于37 ℃ 孵育10 min以停止BP 反應(yīng)。將上述BP 反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DC10B感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的全部菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。從LB平板上挑取5個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量提取并對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 cycles；72 ℃ 7min。

表1 用于基因敲除突變株構(gòu)建和驗(yàn)證的PCR引物

1.6 表皮葡萄球菌感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的表皮葡萄球菌6 mL，1/2體積的超純水洗滌2次，1/5和1/10體積的10%甘油各洗滌一次，最后重懸于80 μL 10%甘油，即得感受態(tài)細(xì)胞。向感受態(tài)細(xì)胞中加入中量提取的重組質(zhì)粒10 μg，混合均勻后轉(zhuǎn)移至1 mm間隙的電擊杯中進(jìn)行電擊。電轉(zhuǎn)條件：電壓2.1 kV，電容25 μF ，電阻100 Ω。立即加入800 μL B2培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)3 h。全部菌液涂布至含10 μg/mL氯霉素的TSB平板上，30 ℃溫箱培養(yǎng)48 h。

1.7 基因敲除突變株的篩選與鑒定 挑取PCR鑒定正確的單菌落接種至3 mL 含10 μg/mL氯霉素的TSB培養(yǎng)基(TSBCm10)，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液1∶100稀釋到50 mLTSBCm10培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液1∶100 稀釋到50 mL TSBCm5培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。菌液稀釋涂布至TSBCm10平板上，42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落接種至5 mL TSB中，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜以促進(jìn)質(zhì)粒丟失。將菌液104倍稀釋涂布至含1 μg/mL脫水四環(huán)素(ATc)的TSB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取50個(gè)菌落分別接種普通TSB平板和TSBCm10平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。選擇10個(gè)僅在TSB平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行基因組DNA提取，以上游同源片段外側(cè)的引物vraSR-IF和下游同源片段外側(cè)的引物vraSR-IR進(jìn)行PCR擴(kuò)增(如圖1所示)，并以野生株基因組作為對(duì)照，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min 30 s，30 cycles；72 ℃ 7 min。若能擴(kuò)增出目的大小的DNA片段，則說(shuō)明vraSR基因已被成功敲除。

2 結(jié) 果

2.1 同源區(qū)域融合片段的獲得 如圖2所示，以表皮葡萄球菌RP62A株基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲得了1 049 bp和852 bp大小的vraSR基因上、下游同源片段，進(jìn)一步通過(guò)融合PCR反應(yīng)將兩段連接起來(lái)，獲得了1 901 bp大小的融合產(chǎn)物。

UF: upstream fragment; DF: downstream fragment.

Fig.1 Schematic chart for the construction of thevraSRknockout mutant

UF: upstream fragment, DF: downstream fragment, UD: upstream + downstream

圖2vraSR操縱子上、下游同源片段的融合PCR反應(yīng)

Fig.2 Fusion PCR product of fragments upstream and downstream of thevraSRoperon

2.2 同源重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR的鑒定 采用引物vraSR-UF和vraSR-DR對(duì)挑取的5個(gè)轉(zhuǎn)化后的DC10B菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示從5個(gè)菌落均擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為1 901 bp的特異性DNA片段(圖2)，表明通過(guò)Gateway克隆技術(shù)成功構(gòu)建了同源重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR。

M: D2 000 marker; Lanes 1-5: five transformants.

2.3 表皮葡萄球菌vraSR基因突變株的鑒定 以上、下同源片段外側(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物vraSR-IF和vraSR-IR，對(duì)挑選的10個(gè)可在脫水四環(huán)素誘導(dǎo)條件下生長(zhǎng)、在含氯霉素培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌落和野生株分別提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示3、4、7、8、9號(hào)菌落的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與野生株的一致，在3.5 kb左右，而1、2、5、6、10號(hào)菌落的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度不到2.5 kb(圖3)，表明1、2、5、6、10號(hào)菌落的vraSR基因被成功敲除。

M: 1 kb DNA marker; Lanes 1-10: ten colonies picked from TSB agar containing ATc; wt: wild type strain.

圖4 表皮葡萄球菌vraSR基因突變株的PCR篩選鑒定

Fig.4 PCR screening forvraSRknockout mutants ofS.epidermidis

3 討 論

CA-MRSA的出現(xiàn)以及表皮葡萄球菌醫(yī)院分離株耐甲氧西林的高發(fā)生率，亟須我們?cè)诨蛩缴细玫乩斫膺@些醫(yī)學(xué)重要葡萄球菌[10-11]。然而，由于無(wú)法對(duì)大多數(shù)的臨床分離株進(jìn)行包括基因敲除在內(nèi)的遺傳操作，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的功能基因組研究受到了很大的限制?，F(xiàn)階段對(duì)金黃色葡萄球菌的功能研究主要通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)室菌株Newman、8325-4，以及近年來(lái)通過(guò)突變一些社區(qū)獲得性耐甲氧西林USA300菌株來(lái)進(jìn)行。而對(duì)于表皮葡萄球菌，可轉(zhuǎn)化的菌株1457和O-47是遺傳研究的主體，但是這些菌株的基因組目前尚未被測(cè)定[7]。本研究利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，經(jīng)大腸桿菌DC10B擴(kuò)增后成功轉(zhuǎn)化了過(guò)去難以轉(zhuǎn)化的表皮葡萄球菌RP62A株，通過(guò)反向選擇成功篩選出了表皮葡萄球菌vraSR突變株，建立了一種強(qiáng)大的可在葡萄球菌實(shí)驗(yàn)室菌株和先前無(wú)法被轉(zhuǎn)化的菌株上通過(guò)同源重組構(gòu)建突變株的方法。

該方法簡(jiǎn)便快捷，適用范圍廣泛，首先體現(xiàn)在同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建方面，基于位點(diǎn)特異性重組的Gateway技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的克隆構(gòu)建省去了酶切連接的步驟。其次，同源重組質(zhì)粒經(jīng)DC10B擴(kuò)增后無(wú)須經(jīng)過(guò)金黃色葡萄球菌RN4220的修飾便可直接轉(zhuǎn)化目標(biāo)菌株，不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟和節(jié)約了時(shí)間和試劑成本，因?yàn)閺腞N4220中提取質(zhì)粒不但需要昂貴的溶葡萄球菌酶，而且往往由于裂解效率低導(dǎo)致質(zhì)粒的濃度和純度都不高，還克服了經(jīng)RN4220修飾的質(zhì)粒僅能轉(zhuǎn)化一小部分親緣關(guān)系較近的金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌分離株的不足。大腸桿菌DC10B的建立與應(yīng)用使得之前難以對(duì)其進(jìn)行遺傳操作的葡萄球菌的研究工作能夠得以開展。最后，反向選擇技術(shù)的應(yīng)用既能提高篩選的效率，又能獲得無(wú)抗生素標(biāo)記的突變株。本研究中作者挑取了50個(gè)菌落進(jìn)行篩選，最后鑒定到5個(gè)菌落的基因被成功敲除，突變株的獲得率不低于10%；而作者曾經(jīng)使用pBT2穿梭質(zhì)粒構(gòu)建雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因lytSR和arlSR的突變株，需要挑取200～400個(gè)菌落，突變株的獲得率通常不足1%[12]。穿梭質(zhì)粒pMAD雖然通過(guò)引入藍(lán)白斑篩選很大程度上提高了篩選效率，但由于需要利用抗生素抗性作為篩選標(biāo)記，因此會(huì)在突變株中引入外源基因。

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Establishment and application of a rapid and efficient method for gene replacement inStaphylococci

ZHU Tao1,DUAN Qin2,LI Chao-pin1,QU Di3

(1.DepartmentofMedicalParasitology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China;2.DepartmentofStomatology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China; 3.KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,MinistryofEducationandHealth,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

We established a rapid and efficient method for creating knockout mutants inStaphylococci. The upstream and downstream homologous regions of thevraSRoperon were combined by fusion PCR, ligated into temperature-sensitive shuttle plasmid pKOR1 by the Gateway cloning technology, and then transformed into a restriction-defectiveE.colistrain DC10B, yielding the recombinant plasmid pKOR1-vraSR. The plasmid was then electroporated intoStaphylococcusepidermidisRP62A strain. Under the selective pressure of high temperature and chloramphenicol, the plasmid was firstly integrated into the chromosome ofS.epidermidisthrough a single crossover event. The integrant strain was then subcultured, and the second crossover occurred subsequently in the absence of antibiotic selection, resulting in either wild-type strain or the mutant, which depended upon where the recombination event occurred. Finally, the culture was plated on the medium containing 1 μg/mL anhydrotetracycline for counter selection, several colonies were picked up and analyzed by PCR to identify the mutant. Result showed that avraSRknockout mutant of the untransformableS.epidermidisRP62A was successfully generated in this study. In conclusion, the method for gene replacement inStaphylococciby usingE.coliDC10B and shuttle plasmid pKOR1 is simple and efficient.

gene knockout;Staphylococci; counter selection; restriction modification system

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.003

李朝品,Email:cpli001@163.com

1.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，蕪湖 241002； 2.皖南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，蕪湖 241002； 3.復(fù)旦大學(xué)教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

R378.1

A

1002-2694(2015)12-1098-05

2015-04-15；

2015-07-09

教育部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.201406)，安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自助研究課題(No.LAB201408),安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.KJ2015A218),省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No.AH201310368111)