豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與生物學(xué)分析

任梅滲，王 印，楊澤曉，姚學(xué)萍，林星宇

豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與生物學(xué)分析

任梅滲1,2，王 印1,2，楊澤曉1，姚學(xué)萍1，林星宇1,2

目的 從四川省某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)病死豬肝臟分離到一株奇異變形桿菌，分析其生物學(xué)特性，為臨床鑒別診斷和治療提供參考。方法 對(duì)分離株進(jìn)行革蘭氏染色、培養(yǎng)特性觀(guān)察、毒力試驗(yàn)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)以及16S rRNA基因序列分析，并且構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 分離株16S rRNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST對(duì)比分析，其與各株奇異變形桿菌同源性均為98%以上，將分離株與GenBank中其他6株不同來(lái)源的變形桿菌與3株不同來(lái)源的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行序列對(duì)比分析并且構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，證明分離株與豬源奇異變形桿菌(HQ259935.1)的同源性最高，為99.8%；與大腸桿菌，沙門(mén)氏菌，克雷伯氏菌的同源性?xún)H為92.1%～93.2%。致病性試驗(yàn)表明分離株對(duì)小鼠LD50為1.86×106CFU/只。分離株對(duì)氨基糖苷類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物中度敏感，對(duì)其他種類(lèi)藥物敏感性較低。結(jié)論 分離株經(jīng)鑒定為豬源奇異變形桿菌，具有較高的耐藥性和致病性。

奇異變形桿菌；豬；分離鑒定；16S rRNA

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)為條件致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種無(wú)莢膜、無(wú)芽孢的革蘭氏陰性桿菌。奇異變形桿菌具有活潑的運(yùn)動(dòng)力，能迅速分解尿素，產(chǎn)生大量硫化氫，在低濃度的瓊脂表面能快速地遷徙生長(zhǎng)，形成環(huán)狀的厚度不一的波狀菌苔[1]。奇異變形桿菌廣泛分布于泥土、水、糞便以及人與動(dòng)物的體表、粘膜、消化道中；可引起人類(lèi)和動(dòng)物的尿道感染，引起尿道炎，腎盂腎炎，也能導(dǎo)致菌血癥、敗血癥[2]。研究表明該菌能夠引起豬發(fā)病并且有一定的致死性，臨床主要表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉、氣喘，引起豬的敗血癥并產(chǎn)生不耐熱腸毒素反應(yīng)而導(dǎo)致病豬致死[3]。近年來(lái)，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原體，在人與動(dòng)物中引起的疫情頻繁發(fā)生[4]，由于近年廣譜抗生素的大量使用，其臨床耐藥菌株也開(kāi)始大量產(chǎn)生并且其耐藥性也不斷增加，這為臨床治療帶來(lái)了更大的困難[5]。本研究針對(duì)從病死豬分離的一株細(xì)菌，根據(jù)對(duì)其進(jìn)行生化鑒定，藥敏試驗(yàn)，生長(zhǎng)特性和序列分析，判定該菌為奇異變形桿菌，以此對(duì)該菌的病原學(xué)研究與臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試驗(yàn)動(dòng)物 從四川地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集病死豬組織。SPF級(jí)昆明小鼠45只，體重為17～20 g，雌雄各半，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.2 試劑與培養(yǎng)基 普通瓊脂、SS瓊脂、血瓊脂，麥康凱瓊脂購(gòu)自?shī)W博星生物技術(shù)(北京)有限責(zé)任公司?？咕幬锼幟艏埰凹?xì)菌微量生化反應(yīng)管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌DH5α為實(shí)驗(yàn)室自行保存，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌分離與純化 無(wú)菌操作取病死豬肝臟接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，挑取光滑，圓形，半透明的單個(gè)可疑菌落涂片鏡檢并且分離純化，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)特性 將分離株分別接種在瓊脂濃度為1.0%、2.0%與3.0%的普通瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h；在5%脫纖綿羊血的血瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種37 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察分離株的生長(zhǎng)情況。

1.5 測(cè)定LD50按照改良寇氏法，用預(yù)試驗(yàn)確定LD100與LD0，在此劑量區(qū)間范圍內(nèi)設(shè)置5個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組隨機(jī)取8只小鼠。每組腹腔注射不同濃度梯度的菌液0.2 mL；另取5只小鼠設(shè)置為陰性對(duì)照組并注射等量生理鹽水。每組小鼠隔離飼養(yǎng)，常規(guī)管理，觀(guān)察臨床癥狀并記錄死亡數(shù)，總共觀(guān)察72 h，每6 h觀(guān)察一次；剖檢死亡小鼠，記錄組織臟器的病理變化，分離致死菌進(jìn)行鑒定，并以改良寇氏法[6]計(jì)算LD50。

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行試驗(yàn)，參照CLSI(2014)藥敏標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[7]。

1.7 生化試驗(yàn) 使用腸桿菌科細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行試驗(yàn)[8]。

1.8 引物設(shè)計(jì) 采用通用引物擴(kuò)增16S rRNA基因，引物序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′，預(yù)期目的片段為1 445 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.9 16S rRNA PCR擴(kuò)增與序列分析 分離株DNA模板用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。擴(kuò)增體系50 μL，Rnase-free H2O 20 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。使用DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收并連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，將重組菌液送華大科技有限公司測(cè)序。使用Blast對(duì)測(cè)序得到的基因序列與GenBank公布的各株奇異變形桿菌16S rRNA基因序列進(jìn)行對(duì)比，利用MEGA4.1軟件中Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)特性與鏡下形態(tài) 從病死豬肝臟分離出1株可疑菌，編號(hào)為PLB-1，在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形，中等大小的半透明菌落；在血瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)α溶血現(xiàn)象；SS瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)圓形，中等大小、扁平，中心黑色的光滑菌落(見(jiàn)圖1、2)。分離株在含1.0%瓊脂的普通培養(yǎng)基上，呈放射狀擴(kuò)散生長(zhǎng)，在含2.0%和3.0%瓊脂的普通培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)同心圓狀擴(kuò)散生長(zhǎng)。其擴(kuò)散速度在含1.0%瓊脂的普通培養(yǎng)基上最快，2.0%次之，在含3.0%瓊脂的普通培養(yǎng)基上擴(kuò)散最慢(見(jiàn)圖3、4、5)。鏡下形態(tài)呈革蘭氏陰性菌，呈現(xiàn)多形性，桿狀居多，球狀偏少。

圖1 在血瓊脂上的生長(zhǎng)特性

圖2 在SS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

圖3 1%瓊脂

圖4 2%瓊脂

圖5 3%瓊脂

2.2 LD50測(cè)定 試驗(yàn)組小鼠2 h后陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，被毛粗亂，6 h后部分小鼠全身震顫，眼角出血。12～30 h為小鼠死亡高峰期，48 h后不再出現(xiàn)死亡，對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)異常。病死小鼠肝臟和腎臟腫大，充血，伴有出血點(diǎn)，肝臟表面出現(xiàn)壞死灶，脾臟邊緣腫大充血，腸道臌氣，惡臭。取肝臟分離細(xì)菌，鑒定結(jié)果為分離株陽(yáng)性。按照改良寇氏法計(jì)算LD50為1.86×106CFU/只。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Note: “S” Sensitivity; “I” Moderate; “R” Resistance.

2.3 藥敏試驗(yàn) 在測(cè)定的21種常用藥物當(dāng)中，無(wú)高度敏感藥物；對(duì)6種藥物中度敏感，占總試驗(yàn)藥物的28.6%，分別是諾氟沙星、新霉素、丁胺卡那、慶大霉素、頭孢噻肟以及頭孢曲松；對(duì)其他15種藥物均為耐藥，占總試驗(yàn)藥物的71.4%(見(jiàn)表1)。

2.4 生化試驗(yàn) 分離株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；尿素、硫化氫，明膠以及MR結(jié)果呈陽(yáng)性；吲哚、VP，七葉苷試驗(yàn)呈陰性；不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇。參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，符合奇異變形桿菌的生化特性(見(jiàn)表2)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

Note: “⊕” positive product acid gas; “+” positive; “-” negative.

2.5 16S rRNA PCR擴(kuò)增使用16S rRNA通用引物，擴(kuò)增分離株16S rRNA基因序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 445 bp，結(jié)果符合預(yù)計(jì)的片段長(zhǎng)度(見(jiàn)圖6)。

1: Product of 16S rRNA by PCR; M: DNA Marker DL2000.

2.6 16S rRNA序列同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 16S rRNA測(cè)序所得序列已上傳GenBank(登錄號(hào)KR133627)。將其與GenBank中各株奇異變形桿菌序列進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，同源性均在98%以上。選取6株變形桿菌屬和3株腸桿菌科的不同屬的16S rRNA序列，用MEGA4.1軟件中Neighbor-jioning方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖7)。分離株P(guān)LB-1與兩株豬源奇異變形桿菌HQ259935.1與AB272351.1同源性最高，為99.6%～99.8%；與AB682277.1(彭氏變形桿菌)、HF947011(普通變形桿菌)，KC210868.1(豪氏變形桿菌)同源性稍低，為98.5%～99.3%，與FJ949577.1(大腸桿菌)、FJ463825.1(沙門(mén)氏菌)，F(xiàn)J655784.1(克雷伯氏菌)同源性?xún)H為92.1%～93.2%，明顯不是同一個(gè)種屬。

圖7 分離株P(guān)LB-1 16S rRNA核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of the PLB-1 isolate

3 討 論

奇異變形桿菌屬于腸桿菌科，變形桿菌屬，是一種革蘭氏陰性的條件致病菌，能夠引發(fā)人和動(dòng)物的尿道感染，引起腎盂腎炎，某些情況下也能導(dǎo)致菌血癥的產(chǎn)生。奇異變形桿菌能產(chǎn)生多種毒力因子，包括ZapA金屬蛋白酶，Hfq分子伴侶和溶血素等[9]。ZapA是鋅金屬蛋白酶的成員，能裂解多種底物，如IgA1，IgA2和免疫系統(tǒng)的防御素，而且ZapA不只是導(dǎo)致IgA鉸鏈部分?jǐn)嗔讯悄軌蛲耆到饷庖咔虻鞍譡10]。Hfq分子伴侶在奇異變形桿菌引起的人和動(dòng)物尿路感染中是重要的影響因素，Hfq能使得其鞭毛大量表達(dá)，引起奇異變形桿菌黏附與侵襲尿路上皮細(xì)胞的能力增強(qiáng)，并且減少宿主體內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，降低宿主的免疫力[11]。本試驗(yàn)從病死豬肝臟分離細(xì)菌，依據(jù)培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)以及16S rRNA序列分析，鑒定分離株為奇異變形桿菌。選取小鼠對(duì)分離株進(jìn)行致病性試驗(yàn)，測(cè)得LD50為1.86×106CFU/只。

奇異變形桿菌有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性，在瓊脂濃度低的培養(yǎng)基上擴(kuò)散速度快，距離遠(yuǎn)，此時(shí)其以CGC的形態(tài)生長(zhǎng)，鏡下呈菌體較長(zhǎng)、多鞭毛的桿菌。由于高濃度的瓊脂不利于其酸性代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散，繼而影響該菌的生長(zhǎng)，所以在瓊脂濃度高的培養(yǎng)基上擴(kuò)散速度較慢，距離較近，此時(shí)奇異變形桿菌以VC的形態(tài)生長(zhǎng)，鏡下呈短桿菌，鞭毛減少[12]。由于奇異變形桿菌感染人和動(dòng)物尿路上皮細(xì)胞的能力受到菌毛和鞭毛的影響，所以CGC的這種生長(zhǎng)形態(tài)可能有助于提高其在尿路上皮細(xì)胞的粘附與定植能力[13-14]。本試驗(yàn)將分離株分別接種在瓊脂濃度為1.0%～3.0%的普通培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示分離株的擴(kuò)散生長(zhǎng)也明顯受到培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂濃度的影響。

有研究表明奇異變形桿菌自身攜帶的R質(zhì)粒能夠在不同細(xì)菌中轉(zhuǎn)移構(gòu)成復(fù)合R質(zhì)粒，許多的R質(zhì)?？稍诋惙N或者異屬之間轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致細(xì)菌的抗性進(jìn)化過(guò)快，耐藥性增加[15-16]。目前多數(shù)奇異變形桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)與氨基糖苷類(lèi)藥物敏感[1,6,14-15]，但本試驗(yàn)分離株無(wú)高度敏感藥物，且僅對(duì)氨基糖苷類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)的少量藥物以及恩諾沙星中度敏感，說(shuō)明養(yǎng)殖場(chǎng)存在濫用抗菌藥物的情況，導(dǎo)致該菌可能存在多種耐藥的質(zhì)?；颍率鼓退幮暂^高，病原性更加突出，臨床上對(duì)于該菌的治療難度加大，所以消除耐藥質(zhì)粒以及研發(fā)新型消除劑還有待更深入的研究。

近年來(lái)，人和動(dòng)物感染奇異變形桿菌的報(bào)道不斷增多，在高密度養(yǎng)殖的飼養(yǎng)場(chǎng)內(nèi)，容易迅速蔓延，引發(fā)流行病。對(duì)于該病防治與診斷技術(shù)的深入研究應(yīng)引起足夠重視。

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Isolation, identification and biological characteristics analysis ofProteusmirabilisfrom swine

REN Mei-shen1,2,WANG Yin1,2,YANG Ze-xiao1,YAO Xue-ping1,LIN Xing-yu1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Chengdu611130,China)

To investigate biological characteristics and provide reference forProteusmirabilisidentification diagnosis and treatment, samples from a large scale pig farm in Sichuan Province were collected for isolation ofProteusmirabilis. The pathogen was tested by gram staining, culture characteristics observation, biochemical tests, antimicrobial susceptibility tests and 16S rRNA gene sequence analysis. Results of alignment analysis indicated that this sequence showed 98% homology with the sequence ofProteusmirabilis. Furthermore, the phylogeny tree that constructed with 6 reference strains ofProteusand 3 reference strains of enteric bacilli indicated that the highest homology with the strain HQ259935.1 was 99.8%. However, the homology with 3 strains of enteric bacilli was only 92.1%-93.2%, which proved that they didn't belong to the same species. In addition, the result of pathogenicity test showed that the LD50was 1.86×106CFU per mouse. And then, the isolated pathogen was moderately sensitive to antibiotics of aminoglycoside and β-lactam, but resistant to others. In conclusion, the pathogen was identified to beProteusmirabilis. In addition, it was proved to have strong pathogenicity and powerful drug resistance.

Proteusmirabilis; swine; isolation and identification; 16S rRNA

Wang Yin, Email: yaanwangyin@tom.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.002

王印，Email：yaanwangyin@tom.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130； 2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130

R378.2

A

1002-2694(2015)12-1093-05

2015-04-28；

2015-07-25

國(guó)家“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2013BAD12B04)

Supported by the "Twelfth Five-Year-Plan" in National Science and Technology for the Rural Development in China (No. 2013BAD12B04)