環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化在胰島素樣生長因子-1抑制耳蝸毛細(xì)胞凋亡中的作用

宮 亮 陳 冬 李 里

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化在胰島素樣生長因子-1抑制耳蝸毛細(xì)胞凋亡中的作用

宮 亮 陳 冬 李 里1

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(P-CREB)對胰島素樣生長因子(IGF)-1抑制小鼠毛細(xì)胞凋亡的作用。方法 體外培養(yǎng)新生小鼠耳蝸基底膜。實(shí)驗(yàn)分為A組：正常對照培養(yǎng)液；B組：慶大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C組：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E組GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞及固定。應(yīng)用TUNEL法觀察各組耳蝸毛細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用Western印跡及RT-PCR法觀察P-CREB的表達(dá)情況。結(jié)果 A組無凋亡細(xì)胞。B組檢測到凋亡細(xì)胞。C組細(xì)胞凋亡較B組明顯減少。D組凋亡細(xì)胞減少最明顯(與B組相比，P<0.05)。E組及F組凋亡細(xì)胞較D組有所增加。P-CREB：Western印跡結(jié)果及RT-PCR結(jié)果表明：A組及B組P-CREB蛋白及mRNA表達(dá)較低。與B組相比，C、D、E及F組P-CREB蛋白及mRNA明顯增加，以D組增加最明顯。結(jié)論 IGF可能通過激活CREB磷酸化抑制毛細(xì)胞凋亡。

毛細(xì)胞；凋亡；胰島素樣生長因子；磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(P-CREB)

環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)屬于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，其調(diào)節(jié)的經(jīng)典通路為G 蛋白-cAMP-PKA 通路。該通路主要是磷酸化激活CREB；激活的CREB之間形成同源二聚體或和其他蛋白結(jié)合形成異源二聚體，后與真核生物啟動(dòng)子中的CRE 結(jié)合對CREB 靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。胰島素樣生長因子(IGF)-1是一種調(diào)控耳蝸生長發(fā)育及細(xì)胞間協(xié)調(diào)穩(wěn)定的生長因子。目前對于IGF-1在神經(jīng)細(xì)胞損傷防護(hù)中的研究較為深入，但在耳蝸發(fā)育過程中及其在耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)中保護(hù)作用及其機(jī)制仍不明確。研究表明IGF-1可以抑制小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡。Lebesgue等〔2〕研究表明：CREB磷酸化(P-CREB)后可以上調(diào)Bcl-2，進(jìn)而抑制海馬椎體細(xì)胞凋亡。P-CREB參與抑制神經(jīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和腎臟細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡〔3〕。本文探討IGF-1抑制凋亡的作用與P-CREB關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，TUNEL 檢測試劑盒購自美國Clontech公司，RT-PCR 試劑盒購自美國Qiagen 公司，IGF-1 由美國Genentech 公司惠贈(zèng)，抗p-CREB抗體及二抗購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 耳蝸基底膜進(jìn)行離體培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為A組：正常對照培養(yǎng)液；B組：慶大霉素(GM)(0.5 mmol/L)；C組：GM(0.5 mmol/L)+IGF-1(1 ng/ ml)；D組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(10 ng/ ml)；E組GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(50 ng/ ml)；F組：GM(0.5 mmol/L)+ IGF-1(100 ng/ ml)。24 h后吸出培養(yǎng)液，再用10%甲醛磷酸鹽緩沖液固定樣品4 h以上，制作各組耳蝸組織鋪片。

1.3 耳蝸毛細(xì)胞凋亡檢測 對各組耳蝸基底膜細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色，加入脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶混合液；陽性對照用DNA酶I，分別以50 mg/L，0.1 g/L，0.5 g/L和1.0 g/L預(yù)處理組織，應(yīng)用多聚甲醛固定后，將其置于穿透液中，陽性結(jié)果為細(xì)胞核紅染。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 Western印跡檢測P-CREB蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測P-CREB蛋白表達(dá)。應(yīng)用HPlsA 1000圖文分析系統(tǒng)分析膠片，用P-CREB與β-actin灰度值的比值表示P-CREB的相對表達(dá)量。

1.5 P-CREB mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR技術(shù)，Access RT-PCR系統(tǒng)將提取的1 μg總RNA擴(kuò)增成DNA目的片段。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：55℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。P-CREB引物：5' GGATCCACGAGCAGAGTCCC 3；5' CCGCCAACCAAGTTCAAGTTCACAGG 3'，235 bp；內(nèi)參照β-actin：5'CCGTTGACATCCGTAAAGAC 3'，5' GCCGGTGGACAGTGAGGC 3'，200 bp。P-CREB的相對表達(dá)水平為P-CREB與β-actin的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞凋亡情況 B、C、D、E、F組加入GM后底回和中回基底膜均存在TUNEL染色陽性細(xì)胞，而A組未發(fā)現(xiàn)。加入IGF-1后，各組中回和底回毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)TUNEL染色陽性細(xì)胞要明顯少于B組。不同濃度IGF-1都可以有效抑制GM對離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸基底膜細(xì)胞的凋亡過程，10 ng/ml IGF-1是體外培養(yǎng)HC及SGC的最佳藥物濃度。超過該濃度后凋亡細(xì)胞數(shù)要顯著增高。見圖1、表1。

圖1 各組凋亡細(xì)胞觀察(×400)

2.2 耳蝸毛細(xì)胞P-CREB蛋白及mRNA相對表達(dá)量 A組及B組P-CREB蛋白及mRNA表達(dá)較低。與B組相比，C、D、E組及F組P-CREB蛋白及mRNA明顯增加，以D組增加最明顯。見圖2、表1。

2.3 相關(guān)性分析 凋亡細(xì)胞率與P-CREB蛋白及mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.987，-0.979，均P<0.05)。

表1 各組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞P-CREB蛋白及mRNA相對表達(dá)量

與A組相比：1)P<0.05；與B組相比：2)P<0.05

圖2 各組P-CREB蛋白表達(dá)

3 討 論

聽力功能下降的主要原因?yàn)槎伱?xì)胞凋亡〔4〕。研究表明敲除IGF-1基因的鼠在內(nèi)耳生長發(fā)育期出現(xiàn)細(xì)胞凋亡〔5〕，同時(shí)聽力出現(xiàn)減退，這說明IGF-1可以在一定程度上調(diào)節(jié)內(nèi)耳毛細(xì)胞凋亡〔6〕。Lakhani等〔7〕發(fā)現(xiàn)IGF-1可以減少耳蝸毛細(xì)胞凋亡。前期結(jié)果表明〔1〕，IGF-1使GM誘導(dǎo)的小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡明顯減少，進(jìn)而保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞，但機(jī)制不清楚。

CREB在細(xì)胞核存在，CREB分子Ser133位點(diǎn)被磷酸化刺激后，CREB具有了轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)與CBP結(jié)合后與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物之間通過相互作用從而進(jìn)行靶基因轉(zhuǎn)錄，CBP只能與P-CREB結(jié)合，故未磷酸化CREB不能完成轉(zhuǎn)錄功能。Peruzzi等〔8〕研究表明，IGF-1作用于神經(jīng)細(xì)胞時(shí)P-CREB增加，未磷酸化的CREB蛋白無變化，表明IGF-1保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞時(shí)通過使P-CREB具有轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。

本文研究結(jié)果說明GM導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡并致耳蝸毛細(xì)胞損傷。IGF-1可以抑制毛細(xì)胞凋亡。應(yīng)用IGF-1后細(xì)胞的凋亡減輕，說明IGF-1有抑制凋亡的作用，同時(shí)出現(xiàn)P-CREB明顯升高，說明在IGF-1抑制凋亡的過程中 CREB出現(xiàn)磷酸化。

1 Guan J.Insulin-like growth factor-1(IGF-1)derived neuropeptides，a novel strategy for the development of pharmaceuticals for managing ischemic brain injury[J].CNS Neurosci Ther，2011;17(4)：250-5.

2 Lebesgue D，Vivien Chevaleyre V，Zukin RS，etal.Estradiol rescues neurons from global ischemia induced cell death：multiple cellular pathways of neuroprotection〔J〕.Steroids，2009;74：555-61.

3 熊 果，馬康華.cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)與細(xì)胞凋亡〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011;31(3)：328-30.

4 Hoang Dinh E，Ahmad S，Chang Q，etal.Diverse deafness mechanisms of connexin mutations revealed by studies using in vitro approaches and mouse models〔J〕.Brain Res，2009;1277：52.

5 Camarero G，Villar MA，Contreras J，etal.Cochlear abnormalities in insulin-like growth factor-1 mouse mutants〔J〕.Hear Res，2002;170：2-11.

6 Savage MO，Camacho-Hubner C，Dunger DB.Therapeutic applications of the insulin-like growth factors〔J〕.Growth Horm IGF Res，2004;14：301-8.

7 Lakhani SA，Masud A，Kuida K，etal.Caspases 3 and 7：key mediators of mitochondrial events of apoptosis〔J〕.Science，2006;311：847-51.

8 Peruzzi，M Prisco，A Morrione，etal.Antiapoptotic signaling of the insulin-like growth factor-I receptor through mitochondrial translocation of c-Raf and Nedd4〔J〕.J Biol Chem，2001;276：25990-6.

〔2013-12-18修回〕

(編輯 苑云杰)

遼寧省教育廳高等學(xué)校科研項(xiàng)目(2014A460)

陳 冬(1972-)，男，教授，博士，主要從事頭頸惡性腫瘤研究。

宮 亮(1980-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事頭頸惡性腫瘤研究。

R76

A

1005-9202(2015)12-3246-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.026

1 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕科