黃麻種子提取物對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用

朱云國，施華娟，程舟*，楊曉伶，李珊，奚秀潔，俞悅純，呂彤，武健壯

(1.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院，上海 200060)

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黃麻種子提取物對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用

朱云國1，施華娟2，程舟1*，楊曉伶1，李珊1，奚秀潔1，俞悅純1，呂彤1，武健壯1

(1.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院，上海 200060)

為探討黃麻種子抗膀胱癌的效果，選取圓果種黃麻“179”、長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”和“福黃麻2號(hào)”三種黃麻種質(zhì)，利用MTT法分析了種子乙醇提取物對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，長果種和圓果種黃麻種子提取物對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制率均極顯著高于目前臨床一線藥物絲裂霉素，且長果種顯著優(yōu)于圓果種，但2個(gè)長果種品種間差異不顯著。因此，有望從黃麻種子中開發(fā)出高效抗膀胱癌成分，這將有助于膀胱癌治療及黃麻種質(zhì)資源的綜合利用。

黃麻；種子；膀胱癌；抗癌活性

黃麻為椴樹科(Tiliaceae)黃麻屬(Corchorus)一年生韌皮纖維作物，是麻紡和造紙工業(yè)的重要原料。黃麻屬約有40-100個(gè)種，遍布整個(gè)熱帶和亞熱帶地區(qū)。目前世界上主栽的黃麻主要有兩個(gè)種，即長果種黃麻(CorchorusolitoriusL.)和圓果種黃麻(CorchoruscapsularisL.)[1-2]。黃麻屬植物種子有毒，內(nèi)含大量強(qiáng)心苷類化合物(Cardiac Glycosides, CGs)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷類化合物具有抗癌活性[4-6]。

膀胱移行細(xì)胞癌(Bladder Transitional Cell Carcinoma, BTCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居世界惡性腫瘤第九位、居我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第一位。雖然70%-80%的初發(fā)膀胱癌為非浸潤性(也稱為表淺性)，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，其復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，并有約15%的患者發(fā)展為浸潤性膀胱癌[7]。目前臨床上主要采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TUR-BT)后定期膀胱灌注絲裂霉素(MMC)等藥物來預(yù)防非浸潤性膀胱癌的復(fù)發(fā)與進(jìn)展。但目前臨床一線藥物絲裂霉素等存在有效率低(僅為30%-40%)和毒副作用大的問題，迫切需要開發(fā)新的高效低毒的抗膀胱癌藥物[8]。

黃麻種子提取物對膀胱癌細(xì)胞的增殖有何影響？是否具有抗膀胱癌功效？能否被用于膀胱癌治療？目前尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用MTT法探討圓果種黃麻“179”、長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”和“福黃麻2號(hào)”三個(gè)黃麻種質(zhì)提取物對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步從黃麻種質(zhì)資源中分離出高效抗膀胱癌成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為圓果種黃麻“179”、長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”和長果種黃麻“福黃麻2號(hào)”的種子。人膀胱癌T24細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，絲裂霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，二甲基亞砜(DMSO)和四甲基噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma，1640培養(yǎng)液、胰酶和小牛血清購自GE公司的HyClone。

1.2 黃麻種子提取物的制備

稱取圓果種黃麻“179”和長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”種子各100 g，經(jīng)粉碎后，分別加入95%乙醇溶液1 L，室溫下密閉浸泡2 h，70℃水浴回流提取3 h。共提取2次，合并收集2次乙醇提取物，過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮分別得浸膏13.4 g(得率為13.4%)和13.6 g(得率為13.6%)，分別記為提取物“Y1”和“C1”，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”和長果種黃麻“福黃麻2號(hào)”種子各100 g，經(jīng)粉碎后，分別加入500 mL石油醚室溫浸提脫脂48 h。過濾后取沉淀再用95%乙醇溶液1 L在室溫下密閉浸泡2 h，70℃水浴回流提取3 h。共提取2次，合并收集2次乙醇提取物，過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮分別得浸膏8.9 g(得率為8.9%)和9.2 g(得率為9.2%)，分別記為提取物“C1TZ”和“C2TZ”，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞鋪6孔板，每孔約100000個(gè)細(xì)胞，生長24 h后，分別換加含有1 mg/mL的提取物“Y1”或“C1”的1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清，下同)，對照為不含提取物的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后，在尼康倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)配成10萬個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板中。過夜細(xì)胞貼壁后，以加100 μL含0.2、1、2、10和20 μg/mL黃麻種子提取物的1640培養(yǎng)液為給藥處理，以加100 μL含10、20、100和200 μg/mL絲裂霉素的1640培養(yǎng)液為陽性對照，以加100 μL不含藥物的1640培養(yǎng)液為空白對照。每個(gè)處理設(shè)6次重復(fù)。培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培養(yǎng)4 h后取出，離心去上清液，每孔加150 μL DMSO，低速振蕩10 min后，用多功能酶標(biāo)儀測490 nm 的OD值，重復(fù)3次。計(jì)算黃麻種子醇提取物和絲裂霉素對人膀胱癌T24細(xì)胞增殖生長的抑制率，并計(jì)算IC50值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)核對整理后，用SPSS 19.0計(jì)算IC50值，并進(jìn)行單因素方差分析，采用最小差異顯著法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃麻種子提取物對T24細(xì)胞形態(tài)的影響

培養(yǎng)12 h后，黃麻種子醇提取物對T24細(xì)胞的生長有明顯影響(圖1)。不含提取物培養(yǎng)時(shí)T24細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整清晰、生長良好，增殖快(圖1 A)。含1 mg/mL黃麻種子醇提取物“Y1”(圖1 B)和“C1”(圖1 C)培養(yǎng)時(shí)，T24細(xì)胞或脫落漂浮于培養(yǎng)液中、或出現(xiàn)空泡、或破碎只剩碎片。表明黃麻種子醇提取物能引起人膀胱癌T24細(xì)胞大量死亡，且長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”種子的醇提物(圖1 C)比圓果種黃麻“179”種子的醇提物(圖1 B)效果更好。

A：對照(不含提取物)，B：含1 mg/mL提取物“Y1”，C：含1 mg/mL提取物“C1”

2.2 黃麻種子提取物對T24細(xì)胞增殖的抑制作用

培養(yǎng)24 h后，MTT結(jié)果顯示，黃麻種子提取物“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”對T24細(xì)胞增殖的抑制有明顯的劑量效應(yīng)，在0.1-10 μg /mL的范圍內(nèi)，抑制率隨濃度加大而升高。在5和10 μg /mL濃度下，黃麻種子提取物“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”對T24細(xì)胞增殖的抑制率均顯著高于對照絲裂霉素，分別是絲裂霉素的2.07、2.61、2.59、2.56和1.64、1.83、1.84 、1.82倍。圓果種黃麻“179”種子的醇提物(“Y1”)在5個(gè)濃度水平對T24細(xì)胞增殖的抑制作用均顯著小于長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”種子的醇提物(“C1”)，與對T24細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果一致(圖1)。提取物“C1TZ”和“C2TZ” 在5個(gè)濃度水平對T24細(xì)胞增殖的抑制率無顯著性差異，表明對T24細(xì)胞增殖的抑制作用在2個(gè)長果種黃麻品種間無顯著性差異。在0.1 μg /mL和1 μg /mL濃度時(shí)，提取物“C1”對T24細(xì)胞增殖的抑制率均顯著小于提取物“C1TZ”，這表明黃麻種子提取物對T24細(xì)胞增殖的活性成分主要在高極性的乙醇中而不是低極性的石油醚中。

注：圖標(biāo)“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”詳細(xì)內(nèi)容見表1；相同濃度下不同小寫字母之間表示處理間差異達(dá)到5%顯著水平

作用T24細(xì)胞24 h后黃麻種子提取物的IC50值均極顯著低于對照絲裂霉素，分別是絲裂霉素的22.5%、7.7%、5.8%和5.4%(表1)?？梢?，黃麻種子醇提取物有望開發(fā)成高活性的抗膀胱癌藥物，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。黃麻種子提取物“Y1”作用T24細(xì)胞24 h后的IC50值均顯著高于提取物“C1”，表明圓果種黃麻“179”種子的醇提物的抗膀胱癌活性顯著小于長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”種子的醇提物，與上面的觀察結(jié)果一致。

表1 不同黃麻種子提取物處理T24細(xì)胞24 h后的IC50值

3 討論與結(jié)論

本研究表明長果種和圓果種黃麻種子提取物對T24細(xì)胞增殖的抑制作用均極顯著高于目前的臨床一線藥物絲裂霉素，并能引起T24細(xì)胞大量死亡?？梢姡L果種和圓果種黃麻種子提取物對膀胱癌細(xì)胞具有比絲裂霉素更強(qiáng)的殺傷作用，有望開發(fā)出高效的抗膀胱癌藥物。另有研究報(bào)道長果種黃麻種子的醇提取物對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞ARH-77有明顯殺傷作用[9]。

長果種和圓果種黃麻種子醇提取物的抗膀胱癌活性成分尚不清楚。2012年Hong & Choi[10]研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷布法林通過誘導(dǎo)凋亡來殺傷膀胱癌T24細(xì)胞。黃麻屬植物種子有毒，內(nèi)含大量強(qiáng)心苷類化合物，推測長果種和圓果種黃麻種子提取物的抗膀胱癌活性成分可能與某種強(qiáng)心苷物質(zhì)有關(guān)。強(qiáng)心苷又稱強(qiáng)心甙或強(qiáng)心配糖體,是一類對心肌有顯著興奮作用的甾體苷類化合物，由強(qiáng)心苷元和糖縮合而成。強(qiáng)心苷類化合物除具有強(qiáng)心作用外，還具有預(yù)防和治療癌癥作用[11]。強(qiáng)心苷類化合物對包括人乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥細(xì)胞均具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且與正常細(xì)胞相比，CGs與癌癥細(xì)胞的親和力更高[5-6]。已有研究表明強(qiáng)心苷類化合物的種類和含量在黃麻種間及種內(nèi)存在差異[3]。不同結(jié)構(gòu)類型的強(qiáng)心苷抗癌活性不同[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”種子的提取物對T24細(xì)胞增殖的抑制作用顯著高于圓果種黃麻“179”，而長果種黃麻“中黃麻4號(hào)”和“福黃麻2號(hào)”品種間差異不顯著。這可能與長果種和圓果種黃麻種間強(qiáng)心苷的種類和含量的差異比種內(nèi)差異更大有關(guān)。

本研究表明長果種和圓果種黃麻種子有望開發(fā)成高效的抗膀胱癌活性成分，有極大的研究和開發(fā)潛力。黃麻易種植，不與糧、棉等大宗農(nóng)作物爭地，可利用開發(fā)山地、鹽堿地等荒地資源。若能從黃麻種子中開發(fā)上市具有廣闊應(yīng)用前景的抗膀胱癌新藥，則將大力促進(jìn)黃麻的種植，增加貧困偏遠(yuǎn)地區(qū)麻民的收入，對膀胱癌治療和黃麻種質(zhì)資源綜合開發(fā)均利用具有重要意義。

[1] 羅素玉, 李德芳, 龔友才, 等. 麻類所麻類育種五十年 [J]. 中國麻業(yè)科學(xué), 2009, 31(1): 82-92.

[2] 陶愛芬, 祁建民, 粟建光, 等. SRAP和ISSR及兩種方法結(jié)合在分析黃麻屬起源與演化上的比較 [J]. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37 (12): 2277-2284.

[3] Khan MSY, Bano S, Javed K, et al. A comprehensive review on the chemistry and pharmacology of Corchorus species—A source of cardiac glycosides, triterpenoids, ionones, flavonoids, coumarins, steroids and some other compounds [J]. Journal of Scientific and Industrial Research, 2006, 65: 283-298.

[4] Slingerland M, Cerella C, Guchelaar H J. Cardiac glycosides in cancer therapy: from preclinical investigations towards clinical trials [J]. Investigatonal New Drugs, 2013, 31 (4): 1087-1094.

[5] Cerella C, Dicato M, Diederich M. Assembling the puzzle of anti-cancer mechanisms triggered by cardiac glycosides [J]. Mitochondrion, 2013, 13 (3): 225-234.

[6] 王燕, 邵榮光, 蔣建東. 強(qiáng)心甙類藥物抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國新藥雜志, 2014, 23 (6): 677-681.

[7] Galsky MD. Bladder cancer: advances in treatment and research [J]. Clinical Advances in Hematology and Oncology, 2010, 8 (4): 234-236.

[8] Bruce LJ, Cheryl TL, James EM. Bladder cancer in 2010: how far have we come? [J]. A Cancer Journal for Clinicians, 2010, 60: 244-272.

[10] Hong SH, Choi YH. Bufalin induces apoptosis through activation of both the intrinsic and extrinsic pathways in human bladder cancer cells [J]. Oncology Reports, 2012, 27 (1): 114-120.

[11] Haux J, Klepp O, Spigset O, et al. Digitoxin medication and cancer: case control and internal dose-response studies [J]. BMC Cancer, 2001(1): 11.

Inhibiting Effect of Jute Seed Extracts on Proliferation of Human Bladder Cancer T24 Cells

ZHU Yun-guo1，SHI Hua-juan2，CHENG Zhou1*，YANG Xiao-ling1，LI Shan1，XI Xiu-jie1，YU Yue-chun1，LYU Tong1，WU Jian-zhuang1

(1. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China;2. People's Hospital of Shanghai Putuo District, Shanghai 200060, China)

In order to investigate the anti-bladder cancer activity of jute seed, inhibiting effects of seed extracts of three jute germplasm (Corchoruscapsularis“179” andCorchorusolitorius“Zhonghuangma No.4 and Fuhuangma No.2”) on proliferation of bladder cancer cells were analyzed by MTT assay. The results showed that the seed ethanol extracts of these three jute germlasm significantly inhibited the proliferation of T24 bladder cancer cells as compared with the current clinical first-line-medicine, Mitomycin. The extract ofC.olitoriuswas much more effective than that ofC.capsularis, while there was no significant difference between two varieties ofC.olitorius. Therefore, jute seed is expected to be developed a highly active anti-bladder cancer drug, which will benefit for the treatment of bladder cancer and the comprehensive utilization of jute resources.

jute；seed；bladder cancer；anticancer activity

1671-3532(2015)06-0312-05

2015-07-01

上海市衛(wèi)生局青年項(xiàng)目(20114Y134);國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目和同濟(jì)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

朱云國(1977-)，男，博士，講師，研究方向：植物種質(zhì)資源遺傳多樣性評價(jià)、挖掘及利用研究。E-mail: ygzhu77@163.com。

*通訊作者：程舟(1967-)，男，博士，教授，研究方向：植物種質(zhì)資源遺傳多樣性評價(jià)、挖掘及利用研究。E-mail: chengzhou@#edu.cn。

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