大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞與周細胞、星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型

查雨鋒，傅曉鐘，張 順，羅 敏，歐 瑜，董永喜，王愛民，王永林

(貴陽醫(yī)學院 1.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心、2.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴陽市婦幼保健院藥劑科，貴州 貴陽 550001)

◇實驗方法學◇

大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞與周細胞、星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型

查雨鋒1，傅曉鐘1，張 順1，羅 敏1，歐 瑜3，董永喜1，王愛民1，王永林2

(貴陽醫(yī)學院 1.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心、2.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴陽市婦幼保健院藥劑科，貴州 貴陽 550001)

目的 應用原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(brain-microvessel endothelial cells,BMECs)與腦微血管周細胞(brain-microvessel pericytes,BMPC)、星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,AS)共培養(yǎng)建立可模擬在體狀態(tài)的體外血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)模型。方法 原代分離、純化和培養(yǎng)大鼠BMECs、BMPC和AS，通過細胞形態(tài)學和免疫細胞化學染色方法鑒定原代培養(yǎng)的細胞，應用Millicell細胞培養(yǎng)插(孔徑0.4 μm)建立5種不同類型的體外BBB模型，經(jīng)跨內(nèi)皮電阻值 (transendothelial electrical resistance,TEER)、熒光素鈉通透性(sodium fluorescent, Na-FLU)、堿性磷酸酶(AKP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT1)的表達測定以及陽性藥在體內(nèi)和體外BBB通透量的相似性，比較評價其屏障功能。結果 原代培養(yǎng)的BMECs呈典型的鋪路卵石樣結構，BMPC胞體較大且呈分枝狀，AS有細長突觸，胞質(zhì)較淺；免疫細胞化學染色證實原代細胞為目標細胞；BMECs與BMPC、AS共培養(yǎng)后TEER值可達(478±25)Ω·cm2，Na-FLU的表觀滲透系數(shù)為[(8.23±0.78)×10-6]cm·s-1，AKP和γ-GT1表達分別為(6.90±0.27)金氏單位·g-1Pro，(4.39±0.32)μg·g-1Pro；陽性藥在體外BBB的表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)與在體數(shù)據(jù)具有較好的相關性(R2=0.92)。結論 原代培養(yǎng)的大鼠BMECs與BMPC、AS共培養(yǎng)建立的體外BBB模型在形態(tài)、結構及屏障功能方面具備BBB的基本特征，為研究BBB的生理學、病理學以及篩選化合物提供了一種有用工具。

原代培養(yǎng)；腦微血管內(nèi)皮細胞；周細胞；星形膠質(zhì)細胞；血腦屏障；形態(tài)學；免疫細胞化學

血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的體外培養(yǎng)模型在生理學、病理學及藥理學等領域都具有巨大的研究價值[1]，為人類對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的認識提供了重大幫助。自從腦微血管內(nèi)皮細胞(brain-microvessel endothelial cells,BMECs)首次在體外分離并培養(yǎng)成功以來[2]，體外BBB模型得到不斷發(fā)展和完善，目前已有多種體外模型的相關文獻報道[3]。由于BMECs的屏障功能隨著體外培養(yǎng)時間及傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，甚至消失[4]，如跨內(nèi)皮電阻值 (transendothelial electrical resistance,TEER)降低，通透性升高等，使得體外BBB的推廣運用受到嚴重阻礙。研究發(fā)現(xiàn)，形成BBB并非BMECs的固有特性，中樞神經(jīng)的內(nèi)環(huán)境是形成BBB的必要條件[5]，而星形膠質(zhì)細胞(astrocytes,AS)是第一個被認為具有調(diào)節(jié)和誘導BMECs形成BBB的關鍵因素[6]，鑒于此，BMECs與AS共培養(yǎng)模型是目前使用最為廣泛的體外BBB模型。腦微血管周細胞(brain-microvessel pericytes,BMPC)是最靠近BMECs的一類細胞，其與BMECs共同擁有一個基底膜，但它對BBB的調(diào)節(jié)作用卻很少被人們所關注[7-8]。文獻報道，BMPC在心血管的生成及BBB的調(diào)節(jié)方面均具有極其重要的作用[9-10]。

本研究采用BMECs、BMPC及AS共培養(yǎng)建立一種新型的體外BBB模型，并對其進行屏障功能驗證，為研究藥物對BBB的影響及藥物透過機制提供有力工具。

1 材料

1.1 動物2 d及10 d的 SD大鼠，♂♀均可，由貴陽醫(yī)學院實驗動物房提供，動物合格證號：SCXK黔2012-0001。

1.2 試劑DMEM高糖培養(yǎng)基(批號8114031)、胎牛血清(FBS，批號1227694)、胰蛋白酶(批號J130049)均購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素(批號15140-122)購Hyclone公司；鼠尾膠原蛋白(批號C8062)、Trition X-100(批號T8200)、Percoll(批號305A046) 、蘇木精(批號20130624)均購自Solarbio公司；膠原酶/分散酶(批號14093221)購自Roche公司；4%多聚甲醛(批號07K29C68)購自博士德生物公司；兔抗大鼠Ⅷ因子相關抗原單克隆抗體(批號bs-2974R)、兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體(批號bs-0189R)均購自Bioss公司；兔抗大鼠GFAP單克隆抗體(批號ab33922)、兔抗大鼠NG2多克隆抗體(批號ab83178)購自Abcam公司；D-Hanks緩沖液(自配)；SP免疫組化試劑盒(批號SP-9001)、DAB顯色試劑盒(批號ZLI-9018)購自中杉金橋公司；Millicell insert(批號14070116)；堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(批號A059-1)購自南京建成生物工程研究所；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT1)ELISA試劑盒(批號ELA4289)購自R&D Systems公司。

1.3 儀器數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)；超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；Allegra 64R 冷凍高速離心機(美國Beckman)；倒置顯微鏡(日本尼康公司)；THZ-100型恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學儀器有限公司)； ERS-2電阻儀(美國密理博公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(美國VARIAN公司)； Modle 680酶標儀(Bio-rad公司)；Acugity-TDQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Waters公司)。

2 方法

2.1 大鼠BMEC的原代培養(yǎng)根據(jù)本實驗室先前報道的方法[11]獲得大鼠BMECs，體外BBB模型的建立均采用第二代的BMECs。

2.2 大鼠BMPC的原代培養(yǎng)依照大鼠BMECs的提取方法分離獲得較純的腦微血管段，用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基懸浮后，接種于鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，以棄除死細胞殘渣，隨后隔天換液1次。延長培養(yǎng)至d 10后，用0.125%的胰酶 (含0.01% EDTA)消化，并于倒置顯微鏡下觀察，待上層的BMECs及膠質(zhì)細胞開始脫落，但BMPC未完全消化時棄除胰酶，用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基輕輕吹打細胞表面，將未脫落的BMECs及膠質(zhì)細胞吹落。棄除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2遍后，添加0.125%的胰酶 (含0.01% EDTA)繼續(xù)消化，于倒置顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)細胞變圓，間隙增大時，棄除胰酶，加入6 mL含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打至細胞脫落，接種于未包被的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后按1 ∶2的方式傳代。體外BBB模型的建立采用3～10代的BMPC。

2.3 AS的原代培養(yǎng)取5只新生1～2 d的SD大鼠，無菌條件下取腦，分離并收集灰質(zhì)于冷DMEM培養(yǎng)液中。將收集到的大腦灰質(zhì)用D-Hanks液清洗3次后，剪成1 mm3左右大小，加入0.25% (含0.02% EDTA)的胰酶，37℃振蕩消化15～20 min，加入含10%FBS的高糖DMEM終止消化，800×g離心5 min，棄上清液，將沉淀用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液混勻，通過200目的濾網(wǎng)，將濾液接種于未包被的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(注：以上操作均在冰上進行)。50 min后吸出培養(yǎng)液，接種于事先涂有鼠尾膠的細胞培養(yǎng)瓶中。12 h后換培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d換1次液。待細胞長成單層，將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)搖床中，200 r·min-1振蕩15 h，吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗2～3次，加入0.125%的胰酶(含0.01% EDTA)消化，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓，間隙變大時，吸出胰酶，加入2～3 mL含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，用滴管輕輕將細胞從瓶壁上吹打脫落，并吹成單個，按1 ∶2傳代。體外BBB模型的建立采用3～10代的AS。

2.4 體外BBB模型的建立在模型建立之前，先用鼠尾膠原蛋白將24孔細胞培養(yǎng)板以及Millicell培養(yǎng)插的內(nèi)側和背側包被并晾干。將BMPC及AS按每平方厘米1.5×104個細胞的密度分別接種于Millicell培養(yǎng)插的背側和24孔細胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h待BMPC及AS完全貼壁后，將Millicell培養(yǎng)插置于24孔細胞培養(yǎng)板中，將BMECs按每平方厘米2×104個細胞的密度接種于Millicell培養(yǎng)插的內(nèi)側，采用BMECs生長培養(yǎng)基培養(yǎng)。于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，直至d 7模型成功。另外，為了探索最佳體外BBB模型，本研究共建立了5種不同類型的體外模型，如Fig 1所示。

Fig 1 Diagram of five different types of in vitro BBB model

2.5 細胞形態(tài)學的觀察將培養(yǎng)有BMECs、BMPC、AS的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁、生長狀況及形態(tài)，并進行拍照。

2.6 免疫細胞組化染色將擴增培養(yǎng)的BMECs、BMPC、AS種于涂有鼠尾膠的6孔板中，當細胞鋪滿板底時吸出培養(yǎng)液，給予4%的多聚甲醛固定1 h，PBS沖洗3次(每次3 min)，按照SP免疫組化試劑盒說明書依次操作。其中BMECs采用兔抗大鼠Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體鑒定；BMPC采用兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體以及NG2多克隆抗體鑒定；AS采用兔抗大鼠GFAP單克隆抗體鑒定。所有一抗均按1 ∶200稀釋。DAB顯色，蘇木精復染，于倒置顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)呈現(xiàn)棕色信號為陽性細胞，陰性對照用PBS代替一抗。

2.7 體外BBB模型屏障功能驗證

2.7.1 TEER測定 采用Millicell-ERS系統(tǒng)于d 7檢測5種不同類型體外BBB模型TEER值，同時測量無細胞的空白Millicell培養(yǎng)插的電阻值作為基準值減去后，乘以培養(yǎng)插面積即為TEER(Ω·cm2)。

2.7.2 Na-FLU通透量測定 待體外BBB模型培養(yǎng)至d 7后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基清洗模型的內(nèi)外側2～3次，每孔內(nèi)側加入200 μL濃度為100 mg·L-1的Na-FLU無血清DMEM溶液，外側加入1.2 mL無血清DMEM，60 min后從池外側取出100 μL培養(yǎng)液用熒光分光光度計測定通過BBB模型的Na-FLU量，通過Artursson系數(shù)公式計算Na-FLU的通透性。

Papp=(dQ/dt)×1/(A·C0·60)

其中dQ/dt表示Na-FLU每分鐘的通透量，A表示培養(yǎng)插的表面積，C0表示Na-FLU的初始濃度，60是將分鐘換算成秒。

2.7.3 AKP的表達測定 模型采用6孔Millicell培養(yǎng)插建立，待模型培養(yǎng)至d 7后，棄除內(nèi)外池培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕漂洗模型2～3次，加入1%Triton X-100細胞裂解液0.5 mL，用移液器輕輕吹打，將單層BMECs吹落，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4℃下裂解60 min后離心10 min(12 000×g，4℃)，取上清液備用。按AKP檢測試劑盒說明書方法檢測。

2.7.4 γ-GT1的表達測定 樣品制備方法與“2.7.3”項相同，按γ-GT1 ELISA試劑盒說明書方法檢測。

2.7.5 體外BBB模型與在體的相似性評價 選用5個已知具有血腦屏障透過性的化合物作為陽性藥進行體外BBB通透性測定，其體內(nèi)數(shù)據(jù)如Tab 1所示。測定方法為：待“EPA”模型培養(yǎng)至d 7后，用無血清的DMEM輕輕漂洗模型2～3次，每孔加入200 μL濃度為200 μmol·L-1的陽性藥無血清DMEM溶液，外側加入1.2 mL無血清DMEM，60 min后從池外側取出100 μL培養(yǎng)液用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定陽性藥通過BBB模型的量，通過Artursson系數(shù)公式計算其Papp，并與體內(nèi)數(shù)據(jù)進行擬合，計算出相關系數(shù)。

Tab 1 List of drugs selected for transport study

aValues are calculated using a tissue distribution model in murine reported in Nakagawa (2009)[12].

2.8 色譜與質(zhì)譜條件色譜柱：Waters BEH C18 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)柱，保護柱：Waters Van Guard BEH C18 (2.1 mm×5 mm, 1.7 μm)；流動相：A：0.1%甲酸乙腈(V/V)，B：0.1%甲酸水(V/V)，全梯度洗脫；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：45℃；進樣體積：1 μL；質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測 (SIR) 掃描模式，以電噴霧離子源(ESI)在正離子電離模式下進行測定，以艾司唑侖為內(nèi)標，用于定量的離子對分別為m/z 267.3(阿替洛爾)、m/z 455.6(維拉帕米)、m/z 189.2(安替比林)、m/z 195.2(咖啡因)、m/z 375.9 (羥嗪)、m/z 261.2(普萘洛爾)、m/z 295.2(艾司唑侖)；錐孔電壓分別為：40 V、50 V、40 V、40 V、45 V、40 V、45 V、40V。

3 結果

3.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)將原代培養(yǎng)的BMECs、BMPC、AS置于倒置顯微鏡下觀察。BMECs呈典型的鋪路卵石樣結構，并呈漩渦狀分布；BMPC胞體較大且呈分枝狀；AS有細長突觸，胞質(zhì)較淺，如Fig 2所示。

3.2 免疫細胞組化染色DAB顯色后，胞質(zhì)顯棕色則為陽性反應。如Fig 3所示，BMECs陽性表達Ⅷ因子相關抗原，AS陽性表達GFAP，BMPC陽性表達α-SMA和NG2，證明所分離細胞正確。

Fig 2 Cell morphology(×100)

A: BMECs; B: BMPC; C: AS

Fig 3 Characterization of primary cells by immunocytochemistry microscopy(×100)

(A),(C),(E)is the negative control of BMECs,BMPC and AS respectively. BMECs express factor-VIII relative antigen(B), while astrocytes are positive for GFAP(D). Pericytes give a positive immunostaining for α-SMA(F) and NG2(G).

3.3 TEER及Na-FLU通透量測定如Fig 4、Fig 5所示，培養(yǎng)至d 7后，BMECs單層模型(E00)的TEER值最低，Na-FLU通透量最高，二元(EA0/EP0)和三元(EAP/EPA)共培養(yǎng)模型的TEER值明顯高于(P<0.01)且Na-FLU通透量明顯低于(P<0.05)單層培養(yǎng)模型。其中以三元共培養(yǎng)模型EPA最優(yōu)，其TEER值為(478±25)Ω·cm2，明顯高于EAP組(P<0.01)，其Na-FLU的Papp為[(8.23±0.78)×10-6]cm·s-1，明顯低于EAP組(P<0.05)。

Fig 4 Transendothelial electrical resistance of the differentin vitro blood-brain barrier ±s,n=5)

**P<0.01vsE00 group;##P<0.01vsEAP group

Fig 5 Apparent permeability coefficient for sodium fluorescent of the different in vitro blood-brain barrier ±s,n=5)

*P<0.05,**P<0.01vsE00 group;#P<0.05vsEAP group

3.4 AKP及γ-GT1的表達測定培養(yǎng)至d 7后，BMECs單層模型(E00)的AKP及γ-GT1的表達均低最低，二元(EA0/EP0)和三元(EAP/EPA)共培養(yǎng)模型均可明顯促進BMECs表達AKP(P<0.01)和γ-GT1(P<0.01)，其中以三元共培養(yǎng)模型EPA的AKP和γ-GT1表達最高，均明顯高于EAP組(P<0.01，P<0.05),見Fig 6、Fig 7。

3.5 體外BBB模型與在體的相似性評價如Fig 8所示，6個陽性藥在體外BBB模型中的Papp與體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)相比具有較好的相似性，r2=0.92。

4 討論

從上世紀80年代以來，體外BBB模型的建立一直是人們研究的熱點，但到目前為止，還未有一個統(tǒng)一的標準來對其進行規(guī)范，導致用于體外BBB建立所用的細胞種類、種屬來源以及模型指標等均具有較大差別。盡管如此，本研究采用同種屬的BMECs與BMPC、AS共培養(yǎng)建立一個穩(wěn)定、可靠以及盡可能接近在體狀態(tài)的體外BBB模型，并通過對一元模型(E00)、二元共培養(yǎng)模型(EA0/EP0)以及三元共培養(yǎng)模型(EAP/EPA)進行多個指標對比，以選出最優(yōu)模型，為今后體外BBB模型的建立提供參考。

Fig 6 Expression of AKP of the different in vitroblood-brain barrier ±s,n=5)

**P<0.01vsE00 group;##P<0.01vsEAP group

Fig 7 Expression of γ-GT1 of the different in vitroblood-brain barrier ±s,n=5)

**P<0.01vsE00 group;#P<0.05vsEAP group

Fig 8 Correlation between Papp of drugs tested at thein vitro blood-brain barrier model(in vitro Papp)and the Pappof the same drugs measured in animal models(in vivo Papp)

能否獲得純度較高的原代細胞是決定體外BBB模型質(zhì)量的關鍵。本研究前期已建立了較為完善的BMECs分離及培養(yǎng)方法，而AS的分離較為簡單，只需通過篩網(wǎng)過濾、差速貼壁及搖床振搖的方法即可純化[13]。BMPC的貼壁能力較強，生長周期較長，對生長條件的需求相對于BMECs較低，因此，可通過培養(yǎng)條件選擇以及延長培養(yǎng)的方法獲得，并通過胰酶分步消化的方法去除貼壁能力較弱的BMECs、神經(jīng)元細胞以及膠質(zhì)細胞，最后接種于未經(jīng)膠原包被的培養(yǎng)瓶中，使貼壁能力較弱的雜細胞不能貼壁生長而進一步純化。

BMPC和AS均可誘導并維持BBB的功能特性，目前，BMECs與AS共培養(yǎng)模型被廣大學者所采用，而BMECs與BMPC共培養(yǎng)模型也有文獻報道[14]，但BMPC與AS對BBB的誘導作用是否具有協(xié)同促進作用，未見相關文獻報道。本研究不僅對5種模型的TEER及Na-FLU進行測定，還對其特異性酶AKP和γ-GT1進行了驗證。所有指標均表明，二元共培養(yǎng)模型優(yōu)于一元模型，并且BMPC對BBB的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于AS；三元共培養(yǎng)模型優(yōu)于二元共培養(yǎng)模型，說明BMPC與AS對BBB的誘導調(diào)節(jié)具有協(xié)同促進作用。此外，EPA模型的各指標均為最優(yōu)，并且其與在體狀態(tài)的解剖結構最為接近，是體外BBB的最佳模型。為了更直觀地反映體外BBB模型與在體狀態(tài)的相似程度，本研究采用6個具有BBB透過性的化合物進行體外篩選，并與體內(nèi)數(shù)據(jù)進行比對，其相關性達0.92，表明本研究所建立的體外BBB模型與在體具有較高的相關性。

綜上所述，采用大鼠BMECs與BMPC、AS共培養(yǎng)可建立穩(wěn)定、可靠、功能和結構與在體相似的體外BBB模型，為BBB的生理病理研究以及跨BBB藥物篩選提供了良好工具，并為今后體外BBB模型的建立提供參考價值。

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Establishment of aninvitroblood-brain barrier model by co-culturing rat brain microvascular endothelial cells, pericytes and astrocytes

ZHA Yu-feng1, FU Xiao-zhong1, ZHANG Shun1, LUO Min1, OU Yu3, DONG Yong-xi1,WANG Ai-min1, WANG Yong-lin2

(1.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,MinistryofEducation,SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 2.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 3.DeptofPharmacy,GuiyangWomenandChildren’sHospitalandHealthInstitute,Guiyang550001,China)

Aim To establishinvitroblood-brain barrier (BBB) model with characteristics of simulation ofinvivoBBB by primitive co-culture of brain-microvessel endothelial cells (BMECs) with brain-microvessel pericytes (BMPC) and astrocytes (AS). Methods BMECs, BMPC and AS from SD rats were primitively isolated, purified and cultured, and then primitive culture cells were identified by cellular morphological and immunocytochemical staining methods. Five types ofinvitroBBB models were established by using Millicell culture insert (pore diameter 0.4 μm) and their barrier functions were evaluated by detection of transendothelial electrical resistance (TEER), permeability of sodium fluorescent (Na-FLU), expression of alkaline phosphatase (AKP) and γ-glutamyl transpeptidase(γ-GT1), and similarity of permeation amount for positive drugsinvitroandinvivoBBB conditions. Results Primitive culture of BMECs presented typical pebbles-like structure, BMPC presented larger soma with branching property, AS presented slender synapse and shallower cytoplasm. Moreover, immunocytochemical staining results identified primitive cells were targeted cells. TEER value for co-culture of BMECs, BMPC and AS reached (478±25)Ω·cm2, permeability coefficients (Papp) value of Na-FLU was [(8.23±0.78) ×10-6]cm·s-1, expression of AKP and γ-GT1 were (6.90±0.27) King unit· g-1Pro and (4.39±0.32) μg· g-1Pro respectively. Moreover, good correlation could be found inPappfor positive controlsinvitroandinvivoBBB models (R2=0.92). Conclusion The establishedinvitroBBB model by using primitive co-culture of BMECs with BMPC and AS possessesinvivoBBB properties in cell morphology, structures and barrier functions, and can be used as a powerful tool for studying physiology, pathology of BBB and screening candidate compounds.

primitive culture; brain microvascular endothelial cells; pericytes; astrocytes; blood-brain barrier; morphology; immunocytochemistry

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.027.html

2015-02-10,

2015-03-13

國家自然科學基金資助項目(No 81260473)；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(黔科合中藥字2012-3013號) ；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項基金(2013-45號)；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(黔科合重G字[2013] 4001)

查雨鋒(1988-)，男，碩士生，研究方向：藥物化學及藥理學，E-mail: 260901461@qq.com; 傅曉鐘(1972-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：藥物化學，共同第一作者,Tel:0851-6908568，E-mail: xiaozhong_fu@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.027

A

1001-1978(2015)05-0730-06

R-332；R322.81；R329.2；R331.37