超濾與醇沉對(duì)黃芪、紅芪抗大鼠腦缺血的影響*

劉永琦， 王志旺， 魏舒暢， 顏春魯， 王瑞瓊， 李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

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超濾與醇沉對(duì)黃芪、紅芪抗大鼠腦缺血的影響*

劉永琦， 王志旺△， 魏舒暢， 顏春魯， 王瑞瓊， 李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

目的：比較超濾法與醇沉法對(duì)黃芪與紅芪保護(hù)腦缺血大鼠作用的影響。方法：將大鼠分為黃芪與紅芪水煎液、醇沉物、超濾物及正常、模型等組，在給藥的基礎(chǔ)上注射地塞米松來(lái)復(fù)制血瘀證模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)扎頸總動(dòng)脈來(lái)復(fù)制腦缺血模型，通過(guò)觀測(cè)腦組織代謝水平及抗氧化系統(tǒng)的活性，研究超濾法與醇沉法對(duì)黃芪與紅芪抗腦缺血作用的影響。結(jié)果：6 g(原生藥)/kg黃芪、紅芪的水提取物及其水提醇沉物與超濾物可明顯提高缺血腦組織中ATP的含量與SOD、CAT的活性，降低MDA的含量，6 g(原生藥)/kg黃芪、紅芪的水提取物及其超濾物可降低腦組織中乳酸以及腦組織含水量；與黃芪、紅芪的水提物相比，在腦組織MDA與含水量、SOD、CAT的活性等方面，黃芪、紅芪的水提醇沉物的作用明顯減弱。結(jié)論：黃芪、紅芪水提液及其醇沉液與超濾液具有明顯的抗腦缺血作用且相同提取方法所得黃芪與紅芪的提取物之間的作用差異不明顯；醇沉法對(duì)黃芪、紅芪的抗腦缺血作用有明顯削弱的影響。

黃芪；紅芪；醇沉法；超濾法；腦缺血；大鼠

2010版《中國(guó)藥典》記載，黃芪(Radix Astragali)、紅芪(Radix Hedyseri)具有相同功效，現(xiàn)代研究顯示，黃芪有一定的抗缺血性腦損傷的作用[1]。中藥水提取液目前應(yīng)用最為廣泛的精制方法是醇沉法，而超濾膜分離技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的除雜分離技術(shù)，在中藥及其制劑的分離純化過(guò)程中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究以黃芪與紅芪為研究對(duì)象，比較醇沉法與超濾法所得黃芪與紅芪提取物對(duì)血瘀合并短暫性腦缺血大鼠模型的保護(hù)作用，為制劑工藝提供藥理學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃芪(Radix Astragali, RA)、紅芪(Radix Hedyseri, RH)，蘭州復(fù)興厚藥材有限責(zé)任有限公司，批號(hào)：20120801、20121001；黃芪水煎液(Radix Astragali decoction, RA-D)、紅芪水煎液(Radix Hedyseri decoction, RH-D)、黃芪超濾物(Radix Astragali Ultrafiltration, RA-U)、紅芪超濾物(Radix Hedyseri Ultrafiltration, RH-U)與黃芪醇沉物(Radix Astragali alcohol solution, RA-A)、紅芪醇沉物(Radix Hedyseri alcohol solution, RH-A)由甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥藥劑研究室提供；地塞米松，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H41020035，產(chǎn)品批號(hào)：12102211；人參再造丸(Renshenzaizao pill, RSZ pill)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020060，產(chǎn)品批號(hào)：1015827。乳酸(lactic acid, LD)、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate, ATP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)與考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20130425、20130411、20130425、20130424、20130405、20130503；其余試劑為分析純。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體重180～200g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(甘)2004-0006。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)為SYXK(甘)2011-0001。

1.3 儀器

Cole-Parmer LabGEN125勻漿機(jī)，北京中科科爾儀器有限公司；N-5600PC型METASH可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；ZMARK酶標(biāo)儀，美國(guó)BioRad生產(chǎn)。

1.4 受試藥的制備

取黃芪與紅芪各600 g，加10倍量水煎煮2次，每次90 min，合并水煎液，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液真空干燥即得黃芪浸膏粉與紅芪浸膏粉，其提取率為27.8%與31.3%。將上述浸膏粉均分為3份，第一份用蒸餾水溶解即為黃芪水煎液與紅芪水煎液；第二份用蒸餾水溶解后加入3倍量的95%乙醇，冷藏24 h后過(guò)濾，濾液回收乙醇后真空干燥即得黃芪醇沉物浸膏粉與紅芪醇沉物浸膏粉，其得率為16.5%與19.1%，加蒸餾水溶解即為黃芪醇沉物、紅芪醇沉物；第三份用蒸餾水溶解后，在壓強(qiáng)0.07 MPa的條件下用10 nm的膜超濾，濾液真空干燥即得黃芪超濾物浸膏粉與紅芪超濾物浸膏粉，其得率分別為22.1%與28.0%，加蒸餾水溶解即得黃芪超濾物與紅芪超濾物。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按6 g(原生藥)/kg的劑量計(jì)算上述受試藥的大鼠用藥量，用蒸餾水配制，冷藏備用。

1.5 造模、給藥

取Wistar雄性大鼠72只，按體重分層隨機(jī)分為9組(n=8)：即正常對(duì)照組(Control group)，模型對(duì)照組(Model group)，人參再造丸組(0.86 g/kg，RSZ pill group)，黃芪水煎液組(1.67 g/kg，RA-D group)、紅芪水煎液組(1.88 g/kg，RH-D group)、黃芪超濾物組(1.32 g/kg，RA-U group)、紅芪超濾物組(1.68 g/kg，RH-U group)、黃芪醇沉物組(0.99 g/kg，RA-A group)與紅芪醇沉物組(1.15 g/kg，RH-A group)。參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法[2]，各組大鼠按上述劑量ig相應(yīng)藥物10 ml/kg，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組ig等量蒸餾水；給藥后隨即按0.2 mg/kg肌肉注射地塞米松1 ml/kg，正常對(duì)照組肌肉注射等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)12 d。末次給藥前禁食9 h，給藥1 h后用水合氯醛麻醉大鼠，分離并結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈60 min后，處死大鼠。

1.6 取材、檢測(cè)指標(biāo)

完整取出腦組織，除去小腦、嗅球及低位腦干等部位，于固定位置分別取兩份：第一份腦組織精密稱重后烘干，再次稱重，計(jì)算腦組織的含水量；第二份腦組織加入9倍量生理鹽水，于冰水浴勻漿，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腦組織中物質(zhì)代謝、抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪、紅芪及其純化物對(duì)血瘀性腦缺血大鼠腦組織含水量的影響

與正常對(duì)照組比較，血瘀合并短暫性腦缺血模型大鼠腦組織含水量顯著增加(P<0.01，表1)；經(jīng)黃芪、紅芪的水提取物、超濾物治療后，腦組織含水量下降，與模型對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05, 0.01)，而黃芪、紅芪的水提醇沉物的作用不明顯。與黃芪、紅芪的水提醇沉物相比，黃芪、紅芪的水提取物的作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示水煎液經(jīng)乙醇沉淀后對(duì)黃芪、紅芪降低腦缺血大鼠腦組織含水量的作用有明顯的影響。

2.2 黃芪、紅芪及其純化物對(duì)血瘀性腦缺血大鼠腦組織LD、ATP的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血瘀性腦缺血模型大鼠腦組織中乳酸(LD)的含量明顯升高，三磷酸腺苷(ATP)的含量顯著下降，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)；黃芪、紅芪的水提取物、超濾物可緩解上述變化，使腦組織中LD含量下降，ATP的含量上升，黃芪、紅芪的醇沉物對(duì)ATP的含量亦有一定的提升作用，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 0.01)。

GroupDose(g/kg)Crudedrug ExtractContentofwaterinbrain(%)Incrementrate(%)Control--76.8±2.0 -Model--81.3±2.6**5.86RSZpill0.64-78.6±1.1#2.34RA-D6.01.6778.2±1.0##△1.82RH-D6.01.8877.9±0.8##△△1.43RA-U6.01.3278.8±0.9#2.60RH-U6.01.6878.7±0.4#2.47RA-A6.00.9979.7±1.63.78RH-A6.01.1580.1±1.94.30

RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsalcohol solution of same crude drugs(RA-A group or RH-A group)

GroupLD(mmol/gprot)ATP(μmol/gprot)Control0.504±0.087831.93±120.57Model0.662±0.101**660.91±97.08**RSZpill0.547±0.095#784.58±113.57#RA-D0.526±0.075##812.92±117.40#RH-D0.531±0.079#806.05±105.81#RA-U0.536±0.086#799.54±114.76#RH-U0.557±0.081#781.73±94.88#RA-A0.568±0.094774.60±91.83#RH-A0.571±0.105765.03±95.37#

LD: Lactic acid; ATP: Adenosine-triphosphate; RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.3 黃芪、紅芪及其純化物對(duì)血瘀性腦缺血大鼠腦組織抗氧化系統(tǒng)的影響

在復(fù)制血瘀性腦缺血模型12 d后，大鼠腦組織抗氧化酶的活性明顯下降，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組腦組織中SOD、CAT的活性明顯下降，而氧化產(chǎn)物MDA的含量顯著上升(P<0.05, 0.01，表3)；經(jīng)黃芪、紅芪的水提取物、超濾物及醇沉物治療后，上述抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的變化得到明顯的緩解(P<0.05, 0.01)；與黃芪、紅芪的醇沉物相比，超濾物的抗氧化作用更強(qiáng)(P<0.05, 0.01)。

GroupSOD(U/mgprot)CAT(mmol/gprot)MDA(μmol/gprot)Control223.65±31.9922.08±6.0342.92±14.79Model171.30±16.97**14.96±4.80*93.89±20.33**RSZpill201.00±25.43#22.81±5.02#62.81±19.36##RA-D229.07±34.68##△29.58±7.50##△55.76±15.13##△RH-D235.58±37.20##31.25±7.93##△△53.05±14.78##△RA-U216.32±32.71##△26.12±6.82##60.99±18.66##RH-U224.72±34.14##28.23±6.94##57.92±15.87##RA-A192.58±19.67#20.22±4.92#73.46±17.06#RH-A196.41±21.45#21.08±5.46#69.94±16.33#

SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; MDA: Malondialdehyde; RSZ pill: Renshenzaizao pill; RA-D: Radix Astragali decoction; RH-D: Radix Hedyseri decoction; RA-U: Radix Astragali ultrafiltration; RH-U: Radix Hedyseri ultrafiltration; RA-A: Radix Astragali alcohol solution; RH-A: Radix Hedyseri alcohol solution

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsalcohol solution of same crude drugs(RA-A group or RH-A group)

3 討論

中藥材中有效成分的含量普遍偏低，富集有效成分、減少服用質(zhì)量(或體積)是大多數(shù)藥材在臨床使用前處理的必須環(huán)節(jié)。水提取法是中藥制劑中運(yùn)用最為廣泛的工藝步驟，因水價(jià)廉易得、操作方便，但中藥水提取液一般體積較大，溶液中存在大量鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、樹膠、糊化淀粉等大分子物質(zhì)及許多微粒、亞微粒及絮狀物等，因此，在中藥制劑中，分離精制是中藥水提取液進(jìn)一步處理的必須工藝。醇沉法與超濾法是對(duì)中藥水提取液進(jìn)行純化處理的常用方法，其中醇沉法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種精制方法，可將溶于水但難溶于乙醇的大分子極性化合物沉淀除去，大大降低了出膏率。但是，醇沉法除去的是否都是無(wú)效成分，越來(lái)越多的報(bào)道對(duì)此持懷疑態(tài)度[3]，此外，醇處理后的液體制劑穩(wěn)定性較差，儲(chǔ)存過(guò)程中易產(chǎn)生沉淀與粘壁現(xiàn)象。超濾膜分離技術(shù)是膜分離技術(shù)之一，可依據(jù)分子量大小通過(guò)物理分離過(guò)程即可有效除去中藥提取液中大分子有機(jī)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉、鞣質(zhì)等，還能除去細(xì)菌、熱源、病毒等雜質(zhì)，在解決中藥服用量大、產(chǎn)品粗糙等缺點(diǎn)方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]；由于藥物有效成分一般為小分子成分，所以超濾法純化藥物時(shí)對(duì)藥物活性成分的影響較小；此外，經(jīng)過(guò)超濾處理后的藥液制成的制劑，其質(zhì)量(如澄明度)與穩(wěn)定性大大提高[5]。

血瘀性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ途褪窃谧⑸涞厝姿商岣哐赫吵矶鹊幕A(chǔ)上，通過(guò)結(jié)扎頸總動(dòng)脈來(lái)復(fù)制的腦缺血模型；一般所說(shuō)腦缺血模型是通過(guò)結(jié)扎或阻塞頸動(dòng)脈或腦動(dòng)脈引起腦組織缺血，因?yàn)榕R床上腦缺血的病人血液黏稠度有不同程度的提高，所以血瘀性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ团c臨床患者更接近，更能反應(yīng)藥物的臨床療效。中藥黃芪與紅芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、益氣固表等功效，現(xiàn)代研究顯示黃芪對(duì)腦缺血?jiǎng)游镉幸欢ǖ谋Ｗo(hù)作用[6-7]。但是，由于黃芪與紅芪提取率高，服用量大、使用不方便而限制了黃芪、紅芪等中藥的臨床應(yīng)用。本次研究以黃芪、紅芪的水提液及其醇沉液與超濾液為考察對(duì)象，在注射地塞米松提高血液黏稠度的基礎(chǔ)上，結(jié)扎頸總動(dòng)脈來(lái)復(fù)制血瘀性腦缺血大鼠模型，考察受試藥抗腦缺血的作用及其純化工藝對(duì)藥效學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪、紅芪的水提取物及其醇沉物與超濾物可明顯提高缺血腦組織中ATP的含量，黃芪、紅芪的水提取物及其超濾物可降低腦組織中乳酸以及腦組織含水量，改善腦組織代謝水平。腦缺血后引發(fā)代謝紊亂，啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致氧自由基大量產(chǎn)生并造成氧化損傷[8-9]。超氧化物歧化酶(SOD)與過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶作為自由基清除劑，其活性的高低可直接反映組織清除氧自由基的能力[10]；丙二醛(MDA)作為過(guò)氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，其含量可評(píng)價(jià)組織中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱[11]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪、紅芪的水提取物及其醇沉物與超濾物能顯著提高血瘀性腦缺血模型大鼠腦組織中SOD、CAT的活性，降低MDA的含量。

同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在降低缺血腦組織含水量與氧化產(chǎn)物、提高腦組織抗氧化酶活性等方面，黃芪、紅芪水提取物及其超濾物的作用比其醇沉物的作用更明顯，提示醇沉過(guò)程對(duì)黃芪、紅芪的水提取液中的有效成分的含量有明顯的影響。文獻(xiàn)報(bào)道亦顯示，在3倍量95%乙醇沉淀黃芪水提取液過(guò)程中，黃芪多糖幾乎全部損失，黃芪甲苷的含量也明顯降低[12-13]，而黃芪多糖是黃芪抗腦缺血的主要有效組分之一[14-15]。因此，在選取醇沉精制工藝時(shí)，應(yīng)綜合考察藥材中的有效組分，保證制劑的有效性。

綜上所述，黃芪、紅芪的水提液及其醇沉液與超濾液具有明顯的抗腦缺血作用，而改善腦組織代謝水平、提高抗氧化能力是其抗腦缺血的機(jī)制之一；相同提取方法所得黃芪與紅芪的提取物之間的抗腦缺血作用未見明顯差異。與水提液相比，醇沉法對(duì)黃芪、紅芪的抗腦缺血有一定的削弱作用，而超濾法有效的保護(hù)了黃芪、紅芪中抗腦缺血的有效組分，表明超濾法在分離提取黃芪、紅芪等富含多糖等中藥過(guò)程中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

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The influences of ultrafiltration and alcohol sedimentation on protective effects of Radix Astragali and Radix Hedyseri against rat’s cerebral ischemia

LIU Yong-qi， WANG Zhi-wang△， WEI Shu-chang， YAN Chun-lu， WANG Rui-qiong， LI Ying-dong

(Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the influences of ultrafiltration and alcohol sedimentation on protective effects of Radix Astragali and Radix Hedyseri against rat’s cerebral ischemia. Methods: Using dexamethasone(im.) and ligating common carotid artery, the rat stasis model combined transient cerebral ischemia was established to evaluate the effects of the ultrafiltration and alcohol sedimentation through detecting antioxidant system and other indexes in brain tissue. Results: The results showed that the 6 g/kg water extract(crude drug), ultrafiltration and alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri could upgrade adenosine-triphosphate(ATP), superoxide dismutase(SOD) and catalase(CAT), and degrade malondialdehyde(MDA) and water content of brain tissue in rat stasis model combined transient cerebral ischemia, the water extract and ultrafiltration of them could degrade lactic acid(LD) of brain tissue, and the effects of alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri become weaker than water extract of them. Conclusion: The water extract, ultrafiltration and alcohol sedimentation of Radix Astragali and Radix Hedyseri have some protective effects on cerebral ischemia in rats, the effective differences of the extract through the same extraction method are not remarkable, and alcohol precipitation method has obvious influences effect on Radix Astragali and Radix Hedyseri.

Radix Astragali(RA); Radix Hedyseri(RH); alcohol precipitation method; ultrafiltration; cerebral ischemia; rat

2014-08-18

2014-10-14

R285.5；R742.3

A

1000-6834(2015)02-132-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.010

△【通訊作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com