基于不同納米材料的側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

謝艷君等

摘 要 真菌毒素毒性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的致癌性和致畸性，對(duì)人體的危害巨大。近年來(lái)，其快速檢測(cè)技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)，在“批量檢測(cè)”的趨勢(shì)下，側(cè)流免疫層析技術(shù)以具有操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)合理，靈敏快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)。本文對(duì)側(cè)流免疫層析檢測(cè)技術(shù)的研究概況及不同納米材料的側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展前景進(jìn)行綜述，以期為側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)的未來(lái)發(fā)展及應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 納米材料； 側(cè)流免疫層析； 真菌毒素； 綜述

1 引 言

側(cè)流免疫層析檢測(cè)技術(shù)（LFIA）也稱(chēng)橫向流動(dòng)免疫檢測(cè)技術(shù)[1]，是出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細(xì)管的吸附作用使樣品在層析材料上移動(dòng)，其中樣品中的待測(cè)物與層析材料上一定區(qū)域的抗體結(jié)合，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物短時(shí)間獲得直觀的測(cè)試結(jié)果。1990年，Beggs等[2]最先將其用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測(cè)定，隨后該技術(shù)逐漸在環(huán)境監(jiān)控[3，4]、食品安全[5，6]、臨床診斷[7，8]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)該技術(shù)也用于動(dòng)物用藥[9，10]、農(nóng)藥殘留[11，12]、霉菌毒素[13]等污染物以及核酸[14，15]、蛋白[16，17]等生物大分子的檢測(cè)領(lǐng)域。

真菌毒素（Mycotoxins）是由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[18]，主要包括黃曲霉毒素（Aflatoxins， AFs）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol， DON）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA， OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone， ZEN）、伏馬毒素（Fumonisins， FBs）等，對(duì)人和動(dòng)物的毒性主要有致癌、致畸、致突變、肝細(xì)胞毒性、中毒性腎損害、免疫抑制和生殖紊亂等。這些真菌毒素會(huì)污染農(nóng)作物，植物及其副產(chǎn)品等，進(jìn)而給人類(lèi)和家畜健康帶來(lái)威脅。世界各國(guó)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中的真菌毒素的含量做出了嚴(yán)格規(guī)定。

目前， 最常見(jiàn)的真菌毒素測(cè)定方法有儀器分析法和免疫分析法等。常用儀器分析法主要有高效液相色譜法（HPLC）[19～24]和色譜質(zhì)譜法[25～29]。儀器分析法作為常規(guī)真菌毒素檢測(cè)方法[30～32]，因其靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠而受到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的青睞，其缺點(diǎn)是：需要對(duì)樣品進(jìn)行較為繁瑣的預(yù)處理；需要具有專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)技能的人員操作；儀器昂貴精密，且所用儀器的檢測(cè)費(fèi)用和維修費(fèi)用昂貴，無(wú)法滿(mǎn)足批量樣品的快速篩查檢測(cè)[33]。隨著特異性抗體技術(shù)的發(fā)展，免疫相關(guān)方法得以迅速發(fā)展，逐漸成為毒素檢測(cè)的新趨勢(shì)[34]。側(cè)流層析免疫檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，特別適合于大批量樣本的檢測(cè)[35]。本文簡(jiǎn)要介紹了側(cè)流免疫層析檢測(cè)技術(shù)，并且列舉出其在真菌毒素快速檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展。

2 側(cè)流免疫層析檢測(cè)技術(shù)

側(cè)流免疫層析技術(shù)是一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速免疫分析方法，主要用于病原體，激素，藥物和代謝物等的檢測(cè)，原理是通過(guò)標(biāo)記抗原或抗體來(lái)識(shí)別待檢物。側(cè)流免疫層析試紙條主要包括樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸收墊、背襯及應(yīng)用于試紙條上的各種試劑，見(jiàn)圖1。根據(jù)待檢測(cè)物分子的大小不同分為兩種主要類(lèi)型：雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。

3 側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

側(cè)流免疫層析是一種將免疫技術(shù)、色譜層析技術(shù)和免疫標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫分析方法，這種層析技術(shù)常常是借助外來(lái)的標(biāo)記物獲得可測(cè)量的信號(hào)來(lái)分析結(jié)果。因此，有必要尋求一種高靈敏的免疫標(biāo)記物，建立準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的真菌毒素檢測(cè)方法。

納米粒子一般是指顆粒尺寸在 1～100 nm 范圍內(nèi)的超微粒子。它具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等特性[38]。與正常粒子相比，納米粒子具有大的比表面積，其光、熱、磁敏感特性和表面穩(wěn)定性較高。同時(shí)，納米材料用于生物分析標(biāo)記物質(zhì)，可大大改善標(biāo)記物的性能，顯著提升現(xiàn)有分析方法的靈敏度及特異性，其在抗原抗體的標(biāo)記上具有很大的應(yīng)用潛能。

納米材料的引入為免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)高靈敏，高特異，快速檢測(cè)奠定了良好的基礎(chǔ)。采用側(cè)流免疫層析技術(shù)對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)當(dāng)中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記物是納米粒子。用于毒素檢測(cè)的納米粒子標(biāo)記物按材料可分為熒光納米粒子、金納米粒子以及磁性納米粒子等。其中熒光納米粒子又包括量子點(diǎn)及其量子點(diǎn)微球、熒光微球以及時(shí)間分辨熒光微球等；金納米粒子包括常規(guī)膠體金及AgAu復(fù)合納米粒子等。以下介紹不同的免疫標(biāo)記物的側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)當(dāng)中的應(yīng)用，見(jiàn)表1。

3.1 熒光標(biāo)記免疫層析技術(shù)

3.1.1 量子點(diǎn)層析技術(shù) 量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）又稱(chēng)無(wú)機(jī)半導(dǎo)體納米晶體，是一類(lèi)由ⅡⅥ族（如CdSe， CdTe， CdS， ZnSe等）或ⅢⅤ族（如InP， InAs等）元素組成的納米顆粒。量子點(diǎn)的粒徑一般介于1～10 nm之間，由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成具有分子特性的分立能級(jí)結(jié)構(gòu)，受激后可以發(fā)射熒光。其中，CdTe是最重要的納米材料之一，常被用作生物標(biāo)記探針。

量子點(diǎn)作為一類(lèi)理想的新型熒光探針，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，它具有寬的紫外線激發(fā)光譜和狹窄對(duì)稱(chēng)的熒光發(fā)射光譜；可精確調(diào)諧的發(fā)射波長(zhǎng)；可忽略的光漂白等優(yōu)越的熒光特性；良好的光化學(xué)穩(wěn)定性；高量子產(chǎn)率，量子點(diǎn)摩爾吸光系數(shù)高達(dá)106 L/（mol·cm）；熒光壽命長(zhǎng)，可接受多次激發(fā)等優(yōu)越的熒光特性，因此，可以很好地應(yīng)用于熒光標(biāo)記。在免疫分析中應(yīng)用是一個(gè)值得引起重視的新領(lǐng)域。

由半導(dǎo)體材料構(gòu)成的納米熒光顆粒量子點(diǎn)，因其具有更穩(wěn)定、更強(qiáng)的熒光特性，并可以進(jìn)行多信號(hào)的同時(shí)檢測(cè)，已有研究者將其用于熒光免疫標(biāo)記檢測(cè)AFB1及ZEN。Ren等[42]制備了一種量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條，用于快速檢測(cè)玉米中AFB1。通過(guò)微乳液技術(shù)將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的CdSe/ZnS量子點(diǎn)包裹在聚合物內(nèi)形成量子點(diǎn)微球（QBs），標(biāo)記抗AFB1單克隆抗體（mAbs），將抗原和驢抗鼠IgG二抗分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線和控制線。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)AFB1線性范圍為5～60 pg/mL，檢測(cè)熒光強(qiáng)度與AFB1含量在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，半抑制濃度（IC50）（13.87±0.16） pg/mL，檢出限為0.42 pg/mL，檢測(cè)時(shí)間為15 min，與膠體金標(biāo)記試紙條相比檢出限低兩個(gè)數(shù)量級(jí)； 將試紙條檢測(cè)結(jié)果與LCMS/MS及ELISA結(jié)果相比，表明試紙條的檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確。endprint

Duan等[63]建立了量子點(diǎn)微球免疫層析法對(duì)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)溶液和玉米中ZEN進(jìn)行檢測(cè)，檢出限分別達(dá)到0.0625 ng/mL和3.6 mg/kg。表明該方法靈敏、快速，適合食物中ZEN的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

量子點(diǎn)探針用于層析法，既提高了靈敏度、特異性，又可實(shí)現(xiàn)快速、定量檢測(cè)，在免疫層析中有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿?。相比膠體金探針，量子點(diǎn)應(yīng)用的報(bào)道較少，其研究剛剛起步，在制備、修飾及抗原抗體標(biāo)記環(huán)節(jié)技術(shù)要求高，偶聯(lián)結(jié)合物后的穩(wěn)定性等方面有待進(jìn)一步提高。

3.1.2 基于時(shí)間分辨熒光免疫分析的層析技術(shù)

時(shí)間分辨免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)（Timeresolved fluorescent immunochromatographic assay， TRFICA）是集時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)和層析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，借助高靈敏的標(biāo)記示蹤物，用于微量物質(zhì)檢測(cè)的一種新興技術(shù)。示蹤物由兩種不同鑭系元素離子（分別作為光吸收子和發(fā)射子）及陶瓷顆粒（作為主基質(zhì)）摻雜組成，這種鑭系螯合物也稱(chēng)為UCP （Upconverting phosphor， UCP）顆粒，優(yōu)于免疫層析常用標(biāo)記物膠體金，它具有較高的靈敏性，高穩(wěn)定性，可通過(guò)時(shí)間分辨熒光免疫層析分析儀結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線實(shí)現(xiàn)定量分析。

李靜等[54]將時(shí)間分辨熒光技術(shù)與免疫層析技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立了時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條測(cè)定油料餅粕中AFB1的新方法。同時(shí)，采用時(shí)間分辨熒光速測(cè)儀實(shí)現(xiàn)了AFB1的定量檢測(cè)。將待檢測(cè)的樣品加入到裝有Eu3+標(biāo)記特異性單克隆抗體的樣品瓶中，將噴涂有T線和C線的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條按箭頭向下插入到樣品瓶中，試紙條插入有內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線的速測(cè)儀配套卡槽中，輸出數(shù)值即為樣品中AFB1的濃度。T線條帶熒光強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成反比。使用該試紙條對(duì)6種油料餅粕做AFB1添加回收實(shí)驗(yàn)，回收率在70%～120%。在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，該試紙條和液相色譜質(zhì)譜結(jié)果相比，相對(duì)誤差低于15%。單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間不足15 min。說(shuō)明該試紙條能檢測(cè)大批量油料餅粕樣品。

張兆威等[5 8]采用Eu3+包覆于硅膠形成的硅膠熒光微粒作為免疫標(biāo)記物，將AFB1抗體與乳膠銪進(jìn)行偶聯(lián)標(biāo)記，建立AFB1時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)法。與已有的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法相比，該方法的靈敏度提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。該試紙條用于花生、稻米、植物油等農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)，檢出限均為0.3 μg/kg。相對(duì)誤差小于10%，說(shuō)明該試紙條可用于農(nóng)產(chǎn)品中AFB1快速檢測(cè)。

Majdinasab等[66]采用TRFICA法研制出快速檢測(cè)OTA的試紙條，檢出限為1.0 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間為8 min。該方法經(jīng)濟(jì)、方便、快速，適合OTA的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

3.1.3 熒光微球免疫層析法 熒光微球免疫層析技術(shù)是利用熒光微球表面修飾的羧基可共價(jià)結(jié)合抗體，通過(guò)該標(biāo)記物發(fā)出穩(wěn)定而強(qiáng)的熒光信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)的新型檢測(cè)技術(shù)。該標(biāo)記物發(fā)光強(qiáng)度受激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)，并且受外界影響小，已有用于毒素檢測(cè)的研究。Liu等[61]建立了基于熒光微球探針的免疫層析法，該法可用于快速篩查受AFB1污染的醬油樣品。所制試紙條的檢測(cè)探針由熒光微球和抗AFB1的抗體交聯(lián)組成，該探針的光學(xué)特性消除了醬油樣品的顏色干擾，可視檢出限達(dá)到2.5 μg/L，低于我國(guó)政府制定的限量標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/L）。結(jié)果表明，熒光微球作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)在有色樣品的檢測(cè)中有較高的研究?jī)r(jià)值和前景。Wang等[64]采用熒光微球免疫層析法對(duì)玉米中FB1進(jìn)行定量檢測(cè)，加標(biāo)回收率在91.4%～118.2%。檢測(cè)結(jié)果與HPLCMS/MS檢測(cè)結(jié)果相一致。

3.2 膠體金免疫層析技術(shù)

3.2.1 金免疫層析法 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。隨著納米技術(shù)的興起和單克隆技術(shù)的發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)成為繼熒光素標(biāo)記技術(shù)、放射性同位素標(biāo)記技術(shù)和酶標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來(lái)的又一種固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床診斷、動(dòng)植物檢疫、微生物檢測(cè)、食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域。

膠體金粒子對(duì)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)吸附能力，可以與免疫球蛋白、毒素、酶、糖蛋白、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合。同時(shí)，膠體金顆粒具高電子密度特性，即金標(biāo)物在相應(yīng)配體處大量聚集，肉眼可見(jiàn)紅色或粉色斑點(diǎn)，因而，目前較多用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法。膠體金免疫層析試紙條以其簡(jiǎn)便快速，成本低廉，結(jié)果直觀，檢測(cè)時(shí)間短，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于AFs、OTA[65]、FBs、DON[67～70]等真菌毒素檢測(cè)。

Song等[39]建立了一種可同時(shí)定量或半定量檢測(cè)谷物樣品中AFB1，ZEA，DON和它們的類(lèi)似物的側(cè)流免疫層析方法。該紙條對(duì)AFB1，ZEA和DON可視檢出限分別為0.03， 1.6和10 μg/kg，檢出限均低于歐盟最大允許值。對(duì)玉米樣品的檢測(cè)結(jié)果與液相色譜質(zhì)譜法相符。

Urusov等[41]改進(jìn)了傳統(tǒng)的免疫層析方法，采用次級(jí)金標(biāo)抗體提高了免疫層析試紙條對(duì)AFB1的檢測(cè)靈敏度。先將非標(biāo)記的黃曲霉毒素專(zhuān)一初級(jí)抗體與待測(cè)樣品混合，將免疫層析試紙條插入混合液中，加入膠體金標(biāo)記的次級(jí)抗體來(lái)結(jié)合檢測(cè)膜上的復(fù)合物。該方法的可視檢出限可達(dá)到160 pg/mL，使用Canon Lide 90平板掃描儀及Totallab實(shí)驗(yàn)室軟件包處理，檢出限甚至可達(dá)到30 pg/mL，而不加次級(jí)抗體的免疫層析檢出限為2 ng/mL。實(shí)驗(yàn)表明，這種處理方法避免了膠體金標(biāo)記抗體與檢測(cè)區(qū)抗原的非專(zhuān)一性結(jié)合，提高了試紙條檢測(cè)的靈敏度。

Moon等[44]采用改良的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，檢出限可達(dá)到10 μg/mL，10 min內(nèi)完成檢測(cè)。將有限的AFB1多克隆抗體固定在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)區(qū)，樣品中待測(cè)物和膠體金偶聯(lián)AFB1BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)區(qū)抗體，相比樣品中抗原，偶聯(lián)抗原結(jié)合受抑制。當(dāng)遷移通過(guò)硝酸纖維素膜時(shí)，被固定的有限抗體捕捉，而膠體金標(biāo)記的AFB1BSA在檢測(cè)區(qū)與抗體結(jié)合呈紅色，待檢物濃度與檢測(cè)區(qū)呈色成反比。該方法與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)法相比，省去了檢測(cè)線，筆者認(rèn)為此法更為簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，因此有必要在此方法的基礎(chǔ)上，對(duì)抗體和毒素最佳濃度以及膠體金和毒素BSA偶聯(lián)物之間的最佳結(jié)合條件進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì)，建立多種毒素檢測(cè)斑點(diǎn)法。endprint

膠體金免疫層析技術(shù)已有半定量和定量研究的報(bào)道。Anfossi等[56]制備了定量檢測(cè)4種主要黃曲霉毒素的試紙條，該試紙條與電腦相連的便攜掃描儀，軟件處理分析實(shí)現(xiàn)分析物定量檢測(cè)。檢測(cè)樣品為玉米，檢出限為1 μg/kg。以水、NaCl溶液、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）、磷酸/檸檬酸緩沖液（pH 5.0）等不同提取溶液測(cè)定回收率。在含水量在76%～94%的水溶液進(jìn)行提取有較高的回收率，提取效果好。pH呈中性的提取液有較好的免疫層析效果。因而，選擇pH呈中性的PBS溶液作為提取液，可有效提高方法的準(zhǔn)確性。

Lee等[71]建立了一種半定量檢測(cè)AFB1的斑點(diǎn)側(cè)流免疫層析檢測(cè)方法，基于智能手機(jī)的閱讀系統(tǒng)（Smartphonebased reading system）實(shí)現(xiàn)及時(shí)、有效、準(zhǔn)確的半定量檢測(cè)。該系統(tǒng)由智能手機(jī)、側(cè)流免疫層析檢測(cè)閱讀器和能夠獲得圖像信息并且進(jìn)行數(shù)據(jù)處理智能機(jī)應(yīng)用程序組成。該方法的檢出限是5 μg/kg，能夠半定量分析樣品中AFB1濃度范圍為5～1000 μg/kg。

Zhang等[59]制備了一種基于肉眼的半定量免疫層析試紙條（NSIstrip），將標(biāo)記有金標(biāo)顆粒的抗黃曲霉毒素單克隆抗體1C11 噴涂于結(jié)合墊上，硝酸纖維素膜上依然有兩個(gè)區(qū)，檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，控制區(qū)上固定兔抗鼠二抗，不同于傳統(tǒng)的試紙條，檢測(cè)區(qū)由3條檢測(cè)線組成，它們均固定限量的AFB1BSA偶聯(lián)物作為捕獲物，該試紙條的肉眼的檢出限是0.06 ng/mL，3條檢測(cè)線的分界閾值分別為0.125，0.5和2.0 ng/mL。因而，可根據(jù)3條線顯色情況將檢測(cè)物濃度劃分為5個(gè)濃度區(qū)段：0～0.06 ng/mL，0.06～0.125 ng/mL， 0.125～0.5 ng/mL，0.5～2.0 ng/mL，>2.0 ng/mL，改良的試紙條能夠提供更多毒素含量參照，較好地實(shí)現(xiàn)分析物的半定量檢測(cè)。

賀亞萍等[72]制備試紙條，采用單光譜成像快速定量技術(shù)，對(duì)食醋中黃曲霉毒素進(jìn)行定量檢測(cè)。該技術(shù)為DT211型黃曲霉毒素單光譜成像速測(cè)儀以膠體金免疫層析試紙條為一級(jí)傳感器，將記錄的檢測(cè)線顯色圖像信息轉(zhuǎn)化為灰度信息，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)等現(xiàn)代處理技術(shù)對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，將灰度信息和黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度關(guān)聯(lián)，達(dá)到毒素的定量檢測(cè)。

膠體金免疫層析法檢測(cè)真菌毒素已有較多報(bào)道，并有商品化的試紙出售。北京中檢維康技術(shù)有限公司推出了iCheck毒素定量快檢卡，此外還配有II型iCheck食品安全定量快檢儀，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。德國(guó)拜發(fā)公司推出了RIDA QUICK Aflatoxin免疫層析法黃曲霉毒素檢測(cè)條，可用于檢測(cè)谷物、豆粕、堅(jiān)果、開(kāi)心果、椰子粉、葵花籽、無(wú)花果、棗椰子及腰果等樣品中的黃曲霉毒素，檢出限4 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間5 min，還可設(shè)定4，10和20 μg/kg等3個(gè)檢出限，此外還配有讀卡儀，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

3.2.2 復(fù)合納米粒子（AgAu）標(biāo)記免疫層析技術(shù)

金包銀納米粒子可放大特異性抗原抗體的反應(yīng)信號(hào)，增強(qiáng)膠體金的顯色效果。Liao等[43]制備了快速檢測(cè)AFB1的免疫層析試紙條。合成了AgAu復(fù)合納米顆粒并用于AFB1抗體的標(biāo)記，和金納米顆粒標(biāo)記抗體技術(shù)相比，試紙條靈敏度，重復(fù)性和穩(wěn)定性都相應(yīng)提高。其原理為利用復(fù)合納米粒子標(biāo)記特異性抗體，檢測(cè)樣品液中特異性抗原，應(yīng)用免疫層析技術(shù)制備、組裝成試紙條。所制備的試紙條的檢出限為0.1 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間為15 min。該試紙條用于檢測(cè)大米、小麥、向日葵、棉花、辣椒和杏仁中AFB1，檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。

3.3 磁珠免疫層析技術(shù)

磁珠免疫層析技術(shù)，它是將磁性納米材料（Magnetic nanoparticle，MNs）的磁信號(hào)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。磁納米探針通常由磁性元素（如Fe， Ni， Co）和它們的氧化物組成[73]。該探針具有粒徑小、比表面積大，穿透性強(qiáng)、可快速移動(dòng)及超順磁性、生物相容性、單分散性良好等特性，可在磁場(chǎng)下定位、富集和分離[74]。此免疫標(biāo)記物具有靈敏、快捷、高效、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用在免疫層析技術(shù)中使該技術(shù)向定量化、高靈敏度、多元化檢測(cè)、層析系統(tǒng)集成化等方向發(fā)展。

4 前景與展望

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)的成熟，為免疫層析技術(shù)真菌毒素的檢測(cè)應(yīng)用注入了新的元素，使得檢測(cè)靈敏度和特異性不斷提高，檢出限甚至達(dá)到pg水平。側(cè)流免疫層析法以其簡(jiǎn)便，快速，靈敏及經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)而被越來(lái)越多地應(yīng)用于大量樣品的快速檢測(cè)，逐漸顯示出其巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。但是，該技術(shù)在真菌毒素快速分析應(yīng)用領(lǐng)域仍存在著一些問(wèn)題，需要深入研究和開(kāi)發(fā)。目前，主要面臨的問(wèn)題及發(fā)展的趨勢(shì)簡(jiǎn)述如下：

（1）受檢毒素高效多元檢測(cè) 真菌毒素污染范圍較廣，多種真菌毒素常常同時(shí)存在于同一種食品或飼料中，且存在多種共存效應(yīng)，對(duì)人類(lèi)健康和家畜構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，用于單一種類(lèi)黃曲霉毒素檢測(cè)的免疫層析試紙條較多，研究多種毒素同時(shí)檢測(cè)的試紙條較少，進(jìn)一步發(fā)揮試紙條快速檢測(cè)的主要策略有：采用單膜多元受體，可以在同一膜上實(shí)現(xiàn)多種毒素的同時(shí)檢測(cè)[39，48，50]；利用納米材料（如量子點(diǎn)QDs）特有的量子尺寸效應(yīng)，如不同粒子尺寸的QDs可以在同一波長(zhǎng)被激發(fā)，發(fā)射出不同波長(zhǎng)的光譜。如此，可以同時(shí)對(duì)毒素分子進(jìn)行分析；將納米材料和層析方式有效結(jié)合在一起，無(wú)須質(zhì)控線直接達(dá)到多檢測(cè)的目的。采用斑點(diǎn)免疫法和多量子標(biāo)記不同偶聯(lián)抗原應(yīng)用在檢測(cè)區(qū)上，與傳統(tǒng)膠體金免疫層析同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素相比，省去了交聯(lián)的檢測(cè)線，節(jié)約了試紙條的空間。實(shí)現(xiàn)多種真菌聯(lián)合檢測(cè)，不僅可有效節(jié)約檢測(cè)成本，又可實(shí)現(xiàn)快速高效檢測(cè)，是今后試紙條研究的方向。

（2）適應(yīng)檢測(cè)基質(zhì)的復(fù)雜性 目前，側(cè)流層析檢測(cè)技術(shù)集中于一些基質(zhì)較簡(jiǎn)單的農(nóng)產(chǎn)品、食品或飼料，諸如花生、玉米、小麥等的真菌毒素檢測(cè)。而在基質(zhì)較復(fù)雜的中藥中的應(yīng)用較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蓮子、生姜等藥食同源的藥材極易受黃曲霉毒素的污染，而且中藥中除AF以外同樣存在著OTA，DON，F(xiàn)B1等多種真菌毒素的共同污染[75，76]。這些受污染的中藥不僅會(huì)對(duì)人的健康產(chǎn)生威脅，而且會(huì)阻礙中藥現(xiàn)代化進(jìn)展。在含有多樣，復(fù)雜成分的中藥中，如何降低性質(zhì)迥異的復(fù)雜成分對(duì)超痕量、劇毒的真菌毒素檢測(cè)的影響是免疫層析技術(shù)在中藥中檢測(cè)應(yīng)用的棘手問(wèn)題。有研究表明：樣品的提取采取水溶液而非有機(jī)溶劑[56]，可明顯改善毒素的回收率，在提取過(guò)程中加入適量的CaCl2[77]，試紙條T線顏色梯度變化，不同濃度加標(biāo)回收率等參數(shù)均有明顯改善，前處理效果明顯；采用TrisHCl對(duì)樣品進(jìn)行稀釋可以減少基質(zhì)效應(yīng)及有機(jī)溶劑甲醇對(duì)檢測(cè)的影響[46]，對(duì)樣品進(jìn)行多倍稀釋[72]，樣品稀釋液過(guò)Al2O3樣品凈化柱[58]可減少基質(zhì)效應(yīng)；在提取過(guò)程中劇烈震蕩，提取時(shí)間較長(zhǎng)，加較多的提取液，通過(guò)“不安定理論”可以了解到這些提取條件均會(huì)增加不安定系數(shù)，增強(qiáng)黃曲霉毒素結(jié)合到谷物或使用容器上的結(jié)合力，為此，在提取中緩和震蕩，縮短提取時(shí)間，加入少量提取液及含吐溫的PB液均可提高黃曲霉毒素回收率，降低基質(zhì)效應(yīng)[48]，為在更復(fù)雜的中藥基質(zhì)的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，因此，尋找一些更為有效的前處理方法，特異性親和力更高的配體，新型標(biāo)記納米顆粒在側(cè)流免疫層析技術(shù)應(yīng)用于更多復(fù)雜基質(zhì)的中藥中有很深遠(yuǎn)的意義，將成為今后研究的重點(diǎn)。endprint

（3）尋找抗原替代品， 實(shí)現(xiàn)“綠色化”檢測(cè) 真菌毒素為小分子化合物，側(cè)流免疫層析檢測(cè)法需要將其偶聯(lián)大分子蛋白（如牛血清白蛋白）作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，此類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)抗原有毒害、獲取困難、價(jià)格昂貴等問(wèn)題[78]。近來(lái)，噬菌體展示技術(shù)來(lái)產(chǎn)生模擬表位肽取代抗原，既降低了制備成本，又提升了抗體效能，真正實(shí)現(xiàn)無(wú)毒無(wú)害檢測(cè)。Lai等[79]將OTA模擬表位肽用于膠體金免疫層析試紙條，該試紙條檢出限為10 ng/mL。為其它毒素?zé)o毒檢測(cè)開(kāi)辟了道路。Wang等[80]篩選出噬菌體展示納米抗體Phage25，將其用作黃曲霉毒素的替代抗原，用ELISA方法證明該抗體具有良好的模擬黃曲霉毒素抗原的生物活性，有望用于側(cè)流免疫層析中黃曲霉毒素的替代品，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素綠色免疫分析。

（4）基于適配體層析技術(shù)的檢測(cè) 側(cè)流免疫層析法在真菌毒素檢測(cè)中應(yīng)用主要是抗原抗體法即免疫學(xué)方法，但這種方法需要制備特異性抗體，而抗體制備成本較高，時(shí)間長(zhǎng)；抗體本身具有不穩(wěn)定性；無(wú)法分離交叉反應(yīng)的物質(zhì)，受免疫源性等的限制，相比抗體，適配體易于合成和修飾，制備時(shí)間短，費(fèi)用低；較穩(wěn)定，由溫度引起的變性是可逆的；沒(méi)有明顯的免疫源性；可以分離結(jié)構(gòu)相似的或交叉反應(yīng)的物質(zhì)[8 1]。Shim等[46]建立了基于適配體的簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法。樣品中AFB1和吲哚二羧菁染料分子（cy5）標(biāo)記的DNA探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生物素修飾的適配子，鏈霉親和素和anticy5的抗體分別固定在試紙條的膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，隨后將該試紙條插入到含待測(cè)物溶液、適配體和DNA探針的混合液中，存在待測(cè)物的樣品，待測(cè)物首先結(jié)合適配體上。而有cy5染料分子標(biāo)記的探針結(jié)合在殘留位點(diǎn)的適配體上，經(jīng)ChemiDocTM MP System熒光系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，該試紙條的檢出限為0.1 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間只需30 min。

（5）實(shí)現(xiàn)半定量和定量檢測(cè) 不同的納米材料在檢測(cè)真菌毒素中有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，磁珠、熒光素標(biāo)記物的試紙條在進(jìn)行定性或定量分析中，需要復(fù)雜、大型、或單一的儀器設(shè)備，難以滿(mǎn)足基層單位對(duì)真菌毒素現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前，膠體金免疫層析試紙條可直接通過(guò)肉眼觀察檢測(cè)條帶顏色深淺對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，在真菌毒素檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛，但較多試紙條只能定性或半定量，而新型微型化、便攜化、自動(dòng)化定量檢測(cè)儀器研究成為免疫層析檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的新趨勢(shì)。

總之，隨著納米技術(shù)、單克隆抗體及其它分子生物學(xué)技術(shù)的融合，側(cè)流免疫層析技術(shù)將會(huì)在真菌毒素的檢測(cè)方面顯示其巨大的優(yōu)越性，也將在更為廣闊的領(lǐng)域得到發(fā)展和應(yīng)用。

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