響應(yīng)面法優(yōu)化牛膝中齊墩果酸超聲波輔助提取工藝

趙明霞,歐陽杰,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京 100083)

響應(yīng)面法優(yōu)化牛膝中齊墩果酸超聲波輔助提取工藝

趙明霞1,2,歐陽杰1,2,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京 100083)

以牛膝為原料,以齊墩果酸提取得率為指標(biāo),采用超聲波輔助提取牛膝中齊墩果酸。分別研究了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對齊墩果酸提取得率的影響,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。結(jié)果表明,齊墩果酸提取的較佳工藝條件是:乙醇濃度70%,提取時(shí)間20min,料液比(w/v)1∶20。在此條件下,齊墩果酸的提取含量為11.14mg/g。

牛膝,齊墩果酸,超聲波輔助,提取工藝

牛膝(Achyranthesbidentata)為莧科牛膝屬的植物,分布于非洲、東南亞以及俄羅斯、朝鮮、中國等地,生長于海拔200～1750米的山坡林下[1]。牛膝的主要功效為補(bǔ)肝腎、清熱火,主治腰膝酸痛、下肢痿軟、咽喉腫痛等[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,牛膝具有免疫調(diào)節(jié)、消炎抗菌、抑制腫瘤等作用[4-6]。在衛(wèi)生部2009年公布的《藥食同源品名單》中,牛膝被列入保健食品的物品名單。

齊墩果酸(Oleanolic acid)為五環(huán)三萜類化合物,是牛膝中最主要的活性物質(zhì)之一[7-8]。齊墩果酸的提取方法主要有甲醇和乙醇超聲提取并用大孔吸附樹脂純化,超臨界CO2流體萃取技術(shù)等[9-11]。牛膝齊墩果酸具有較高的開發(fā)利用價(jià)值,它既可以用于藥品,又可以用于功能食品和保健食品中[12-14]。本論文以牛膝為原料,采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,優(yōu)化了超聲提取齊墩果酸的方法,具有一定的研究和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

懷牛膝 購自同仁堂藥店;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 購于中國食品藥品檢定研究院;無水乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為分析純 北京化學(xué)試劑公司。

T6紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;TGCX2-2B超聲循環(huán)提取機(jī) 北京弘祥隆生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2mg,以無水乙醇為溶劑,定容于10mL容量瓶中,即得0.2mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL(即分別含齊墩果酸0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg),置于具塞試管中,60℃加熱揮去溶劑后,加5%香草醛-冰醋酸0.2mL,高氯酸0.8mL。然后在70℃水浴中加熱15min,取出冷卻至室溫。再加乙酸乙酯定容至5mL,搖勻,在最大波長560nm處測定吸光度,同時(shí)以未加對照品的試劑空白作參比。以吸光度為縱坐標(biāo),齊墩果酸含量為橫坐標(biāo),得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A560nm=11.315C+0.0523,R2=0.9965。

1.2.2 牛膝齊墩果酸的提取 將牛膝清洗干凈,于70℃干燥4h,粉碎過40目篩,得牛膝粉末。稱取1g加入適量乙醇,在設(shè)定溫度下超聲波處理一定時(shí)間,處理后離心30min,浸提1h后抽濾,測定濾液中的齊墩果酸含量。

齊墩果酸提取含量(mg/g)=(CV)/M,其中,C:根據(jù)回歸方程計(jì)算齊墩果酸濃度(mg/mL);V:齊墩果酸提取液定容體積(mL);M:原料質(zhì)量(g)。

1.2.3 齊墩果酸提取的單因素實(shí)驗(yàn)方法 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,在料液比為1∶15,超聲時(shí)間30min的條件下,分別選取乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行超聲提取。料液比對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,乙醇濃度為70%,超聲時(shí)間30min的條件下,分別選取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(w/v)進(jìn)行超聲提取。提取時(shí)間對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,料液比1∶25,乙醇濃度70%下,分別選取超聲時(shí)間10、20、30、40、50min進(jìn)行超聲提取。

1.2.4 齊墩果酸提取的響應(yīng)面分析方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,應(yīng)用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對提取乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)借助Design Expert 軟件,因素的水平及編碼如表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Central Composite design experimental factor and coding

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值,顯著性分析采用SPSS17.0軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響

乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響如圖1所示。隨著乙醇濃度的升高,齊墩果酸的提取含量先升高后下降,這可能與齊墩果酸的極性有關(guān),當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),齊墩果酸的極性與之最為接近,所以提取含量最高,達(dá)到8.89mg/g,因此選70%乙醇濃度較為合適。

圖1 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of oleanolic acid

2.2 料液比對齊墩果酸提取含量的影響

料液比對齊墩果酸提取含量的影響如圖2所示。隨著料液比增加,溶劑用量增加使得齊墩果酸的擴(kuò)散濃度差增大,提高了擴(kuò)散速度,提取含量迅速增加,當(dāng)料液比為1∶25(w/v)時(shí),提取含量達(dá)到10.62mg/g。當(dāng)料液比為1∶30(w/v)時(shí),齊墩果酸提取含量有所下降,可能是實(shí)驗(yàn)誤差所致。理論上,隨著料液比越大,提取出的齊墩果酸應(yīng)越多,但在整個(gè)提取過程中也會(huì)有部分損失而帶來誤差。

圖2 料液比對齊墩果酸提取含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of oleanolic acid

2.3 超聲時(shí)間對齊墩果酸提取含量的影響

當(dāng)超聲功率為500W時(shí),超聲時(shí)間對齊墩果酸提取含量的影響如圖3所示。超聲波時(shí)間太短對細(xì)胞破損造成的影響較小,仍有較多齊墩果酸在細(xì)胞內(nèi)沒有被提取出來;超聲波時(shí)間太長,超聲波可能對齊墩果酸造成影響,使齊墩果酸提取含量減少。合適的超聲時(shí)間是20min,提取含量是10.32mg/g。

圖3 提取時(shí)間對齊墩果酸提取含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of oleanolic acid

2.4 齊墩果酸提取響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及模型的建立 依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度A、提取時(shí)間B和料液比C為變量,以齊墩果酸Y為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

經(jīng)Design Expert 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,經(jīng)過響應(yīng)面的回歸分析得到如下回歸方程為Y=11.48+0.27A+0.21B+0.98C+0.055AB+0.040AC+0.013BC-1.55A2-1.68B2-1.19C2

表3為回歸方程方差分析表,實(shí)驗(yàn)所選用模型顯著(p<0.0001),擬合度好。方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明,因素A和C對齊墩果酸含量的線性效應(yīng)顯著,二次項(xiàng)影響顯著,其余因素影響不顯著,具體見表4。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and result of response surface methodology test

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance table

2.4.2 響應(yīng)面圖分析結(jié)果 將一個(gè)因素同定在零水平,利用Design Expert 7.0軟件即可作出三種因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。響應(yīng)面分析中,回歸方程中各變量對響應(yīng)值的影響顯著性由F檢驗(yàn)判定,理論上p值越小,則對應(yīng)的響應(yīng)值越顯著。當(dāng)p<0.0001時(shí),說明其所對應(yīng)的條件對響應(yīng)值的作用是極顯著的,p<0.05時(shí)則認(rèn)為其影響顯著。逐項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明,一個(gè)一次項(xiàng)(C-C),三個(gè)二次項(xiàng)(A2,B2,C2)是對牛膝齊墩果酸提取含量影響顯著的項(xiàng)(p<0.0001)。綜合來看,二次項(xiàng)對響應(yīng)值的影響顯著,說明各實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。圖4A、圖4B顯示了固定提取時(shí)間和料液比后,乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響,由于齊墩果酸易溶于有機(jī)溶劑,隨著乙醇濃度的升高,齊墩果酸的提取含量先升高后下降,這可能與齊墩果酸的極性有關(guān)。當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),齊墩果酸的極性與之最為接近,所以提取含量最高。圖4A、圖4C顯示固定乙醇濃度和料液比后,提取時(shí)間對齊墩果酸提取含量的影響。隨著提取時(shí)間的增加,牛膝齊墩果酸提取含量先增加后減小。這說明充足的提取時(shí)間對于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、擾動(dòng)細(xì)胞表面、提高齊墩果酸釋放率是必須的。但是繼續(xù)增加時(shí)間會(huì)有其他雜質(zhì)溶出,引起物質(zhì)純度降低。圖4B、圖4C顯示固定乙醇濃度和時(shí)間后,料液比對齊墩果酸的提取含量的影響,在1∶25時(shí)提取含量最高,隨后提取含量減小,盡管料液比增加有利于齊墩果酸溶出,但在整個(gè)提取過程中總會(huì)有原料和成品的損失,料液比越大,損失越大,所以齊墩果酸提取含量在料液比1∶30(w/v)時(shí)有下降趨勢。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression equation significance test

圖4 齊墩果酸提取得率影響的響應(yīng)面交互作用圖Fig.4 Response surface plot for the effects on the extraction yield of oleanolic acid

2.4.3 最佳工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所得到的模型,得到最佳工藝條件是乙醇濃度70.93%,提取時(shí)間20.66 min,料液比1∶20.08,在此條件下齊墩果酸的最大提取含量是11.70mg/g。為了檢驗(yàn)預(yù)測結(jié)果是否與實(shí)際值相似,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),考慮到實(shí)驗(yàn)方便可行,將較佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度70%,提取時(shí)間20min,料液比1∶20(w/v)。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),齊墩果酸的提取率為(11.14±0.14)mg/g,與響應(yīng)面預(yù)測值11.70mg/g相比,相對誤差在5%以內(nèi)。與模型的預(yù)測值基本一致,由此可以得出該模型可以很好的模擬齊墩果酸的提取條件。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和Design Expert 7.0對牛膝中齊墩果酸的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,較優(yōu)提取條件為乙醇濃度70%、提取時(shí)間20min、料液比1∶20。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為11.14mg/g,與預(yù)測值11.70mg/g相接近,說明響應(yīng)面模型可以很好的模擬齊墩果酸的提取條件。本研究結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)提供了相應(yīng)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),下一步研究將進(jìn)行放大提取。

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《食品工業(yè)科技》雜志社

Optimization of ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid from achyranthes by response surface methodology

ZHAO Ming-xia1,2,OUYANG Jie1,2,*

(1. Department of Food Science and Engineering,College of Biological Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2. Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Oleanolic acid was extracted from achyranthes root by ultrasonic assisted extraction. The effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,and extraction time on the extraction yield of oleanolic acid were investigated. The extraction technology was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions of oleanolic acid were as follows:ethanol concentration was 70%,extraction time was 20min,and solid-liquid ratio was 1∶20. Under above conditions,the extraction yield of oleanolic acid reached 11.14mg/g.

Achyranthes;oleanolic acid;ultrasound assisted;extraction

2014-04-15

趙明霞(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。

*通訊作者:歐陽杰(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

第44批回國留學(xué)人員科研啟動(dòng)基金。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.048