Fe3O4-SiO2載體制備和脂肪酶固定化條件優(yōu)化

易笑生,胡 鐵,馮 超,谷政偉,黎繼烈，*,李昌珠

(1.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中南林業(yè)科技大學(xué)),湖南長沙 410004;2.廣州航海學(xué)院,廣東廣州 510725;3.湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南長沙 410004)

Fe3O4-SiO2載體制備和脂肪酶固定化條件優(yōu)化

易笑生1,胡 鐵2,馮 超1,谷政偉1,黎繼烈1，*,李昌珠3

(1.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中南林業(yè)科技大學(xué)),湖南長沙 410004;2.廣州航海學(xué)院,廣東廣州 510725;3.湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南長沙 410004)

通過共沉淀法和溶膠-凝膠法制備了Fe3O4-SiO2磁性納米粒子,將Fe3O4-SiO2磁性納米粒子表面進(jìn)行氨基化修飾得到磁性納米復(fù)合載體,用掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜對(duì)載體進(jìn)行了表征。通過考察加酶量、戊二醛濃度,固定化時(shí)間和溫度等因素對(duì)蛋白固載率和脂肪酶活力的影響,獲得了脂肪酶固定化的最適條件。在0.02g/mL脂肪酶液加入量為8.30mL,戊二醛濃度為8.20%時(shí),在溫度24℃條件下,固定化4h,制備的固定化脂肪酶酶活3449U/g。

磁性納米復(fù)合載體,脂肪酶,固定化

脂肪酶包括羧酸酯酶和真脂肪酶[1]。脂肪酶的天然底物是油脂,能水解油脂中脂肪酸和甘油相連接的酯鍵[2],能在油-水界面上催化酯水解、醇解、酯交換、酯合成、內(nèi)酯合成、高聚物合成、多肽合成及立體異構(gòu)體拆分等反應(yīng)[3-4]。由于脂肪酶具備高度底物特異性、位置特異性和立體特異性,是食品與油脂加工良好的生物催化劑[5]。

由于在生產(chǎn)中使用游離酶存在難以分離和利用率低的缺點(diǎn),酶固定化技術(shù)得到了迅速發(fā)展。目前用于固定化酶的載體種類很多,磁性載體用于脂肪酶的固定化,具有易于分離和在磁場中定位性好的特點(diǎn)而備受關(guān)注[6-8]。但是脂肪酶價(jià)格高且穩(wěn)定性較低,其規(guī)?；瘧?yīng)用仍然面臨許多問題。磁性納米Fe3O4-SiO2載體是一種價(jià)格相對(duì)低廉的樹脂載體,能與酶分子表面的氨基(-NH2)、羥基(-OH)或巰基(-SH)形成共價(jià)結(jié)合使其固定化[9-10]。為了獲得合適的磁性納米Fe3O4-SiO2載體和固定化脂肪酶的最佳工藝條件,本文通過合成Fe3O4-SiO2載體和對(duì)其表面改性,探討固定化脂肪酶的優(yōu)化條件,旨在改善脂肪酶的催化性能和穩(wěn)定性,降低脂肪使用成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂肪酶 實(shí)驗(yàn)室分離純化制得,酶活力為1400U/g,配制成0.02g/mL脂肪酶液備用;正硅酸乙酯(TEOS),酒石酸,FeCl3·6H2O,FeSO4·7H2O,乙醇,氨水,γ-氨丙基三乙氧基硅烷(3-APTES),甲苯,丙酮,三羥甲基氨基甲烷(Tris,AR),戊二醛(25%),聚乙烯醇(PVA),95%乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

JEOL-6380LV型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM) 日本電子公司;330FT-IR型傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR) 美國Nicolet Co。

1.2 載體制備

共沉淀法制備Fe3O4納米粒子:在250mL三口燒瓶中分別加入100mL去離子水、0.01mol FeCl3·6H2O和0.005mol FeSO4·7H2O,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,升溫至80℃,在轉(zhuǎn)速500r/s條件下,加入10mL濃氨水溶液,繼續(xù)攪拌反應(yīng)30min后冷卻至室溫,用去離子水洗至中性。將得到的納米粒子分散于50mL水中,加1mL酒石酸作為穩(wěn)定劑,70℃下攪拌30min,得到Fe3O4納米流體。

溶膠-凝膠法制備Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體:取Fe3O4納米流體10mL,加入含有10mL TEOS、10mL乙醇、10mL水、0.3mL氨水的混合物中,室溫條件下控制轉(zhuǎn)速500r/s,反應(yīng)12h。

Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體表面氨基化:在500mL圓底燒瓶中,加入100mL甲苯,3g干燥的磁性Fe3O4-SiO2納米粒,超聲處理10min后,加入10mL 3-APTES,在120℃油浴中連續(xù)磁力攪拌4h,甲苯和丙酮各洗滌3次,真空干燥,得到表面經(jīng)氨基修飾后的磁性Fe3O4-SiO2納米載體。

1.3 脂肪酶的固定化

在50mL錐形瓶中,加入0.05g氨基修飾的磁性Fe3O4-SiO2納米載體,0.2mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液和一定濃度的戊二醛,放入100r/min轉(zhuǎn)速的搖床,室溫條件下反應(yīng)12h,用去離子水充分洗滌,得到表面醛基化的磁性載體。在50mL錐形瓶中加入0.05g醛基化載體,10mL pH7.5磷酸鹽緩沖溶液和0.02g/mL脂肪酶液10mL,在設(shè)定溫度下,水浴搖床反應(yīng)一定時(shí)間,離心后得固定化脂肪酶。

1.4 載體表征

1.4.1 載體粒徑檢測 用SEM檢測載體的粒徑,按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行樣品處理與測定。

1.4.2 載體表面氨基化程度檢測 用FTIR檢測載體表面氨基化程度,按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行樣品處理與測定。

1.5 蛋白固載率、酶活力及酶活回收率測定

蛋白固載率、酶活力及酶活回收率按文獻(xiàn)[11]測定。

1.6 固定化酶的單因素實(shí)驗(yàn)

1.6.1 加酶量對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 取濃度5%的戊二醛為交聯(lián)劑,25℃下分別取0.02g/mL酶液2、4、6、8、10、12mL固定化4h。

1.6.2 戊二醛濃度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 取濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%的戊二醛溶液10mL為交聯(lián)劑,25℃下加10mL酶液固定化4h。

1.6.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 取濃度為5%的戊二醛為交聯(lián)劑,25℃下加入10mL酶液固定不同時(shí)間,分別為2、4、6、8、10h。

1.6.4 固定化溫度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 取濃度為5%的戊二醛為交聯(lián)劑,固定化溫度分別為20、25、30、35、40、45℃時(shí)加入10mL酶液固定化4h。

1.7 固定化脂肪酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步提高固定化脂肪酶的效果以及對(duì)其重要影響因素在全局范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選4h為最佳固定化時(shí)間,取其余三個(gè)因素作為Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

表1 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)因素及其水平表Table 1 Factors and levels of the variables tested in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 載體粒徑分析

通過掃描電鏡觀察Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的形態(tài)和大小。圖1為Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體的SEM照片,載體粒徑較為均一,呈球狀,各載體間分散性良好,載體平均粒徑為300nm左右。

圖1 磁性Fe3O4-SiO2復(fù)合載體SEM圖Fig.1 SEM graph of compound magnetic Fe3O4-SiO2 carriers

2.2 載體表面氨基化程度分析

在FTIR下測定干燥的氨基化磁性復(fù)合Fe3O4-SiO2載體與未氨基化磁性復(fù)合Fe3O4-SiO2載體的各基團(tuán)的特征吸收峰。對(duì)該圖譜進(jìn)行紅外圖譜[12]分析,可知-NH:1579cm-1,-NH彎曲振動(dòng);Si-O-R,1100cm-1,伸縮振動(dòng)。所以說明SiO2已包覆到Fe3O4上,-NH鍵吸收峰說明氨基已加至載體表面,磁性復(fù)合載體表面氨基化良好。

圖2 氨基化載體和未氨基化載體FTIR圖Fig.2 Infrared spectrogram of silanized magnetic silica and magnetic silica

2.3 固定化酶的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 加酶量對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 隨加酶量增加,蛋白固載率也增加,但當(dāng)加酶量達(dá)到10mL后,蛋白固載率維持不變。酶活回收率在加酶量達(dá)到8mL時(shí)達(dá)到最大值。說明雖然蛋白固載率增加,但酶活并沒有隨其明顯增加。這是因?yàn)檩d體可固定的酶量是有限的。當(dāng)加酶量濃度較低時(shí),隨著酶液濃度的增加,固定到載體上的酶量增加,活性也相應(yīng)提高,但當(dāng)酶液濃度過高時(shí),酶分子相互聚集成團(tuán)致使酶分子的活性中心互相遮蓋,影響了酶與底物的結(jié)合,使酶活降低。

圖3 加酶量對(duì)固定化脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of the amount of lipase enzyme on activity of immobilized lipase

2.3.2 戊二醛濃度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 戊二醛濃度升高蛋白固載率和酶活回收率均升高,在戊二醛濃度8%時(shí)蛋白固載率和酶活回收率均達(dá)到最大值,但隨戊二醛濃度的進(jìn)一步升高,蛋白固載率與酶活回收率均降低,說明過高濃度的戊二醛使部分酶蛋白失活。

圖4 戊二醛濃度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on activity of immobilized lipase

2.3.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 隨固定化時(shí)間增加,蛋白固載率和酶活回收率都在4h后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值,繼續(xù)延長固定化時(shí)間對(duì)增加酶活力影響不大,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中固定化時(shí)間取4h。

圖5 固定化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶活力的影響Fig.5 Effect of the immobilized time on activity of immobilized lipase

2.3.4 固定化溫度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響 隨固定化溫度的升高,蛋白固載率與酶活回收率也升高,在25℃時(shí),酶活回收率達(dá)到最大值,隨溫度升高,蛋白固載率在較小的范圍內(nèi)變動(dòng),但酶活回收率降低,說明該酶對(duì)溫度比較敏感,雖然酶固定到了載體上,但有部分酶失活。

圖6 固定化溫度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響Fig.6 Effect of the immobilized temperature on activity of immobilized lipase

2.4 固定化脂肪酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn) Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Benhnken design

2.4.2 方差分析及二次回歸擬合 對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,建立二次響應(yīng)面回歸模型,各因素經(jīng)回歸擬合后,解得回歸方程為:

Y=3430.97+57.01X1+19.81X2-17.93X3+47.55X1X2+31.07X1X3-20.67X2X3-183.12X1X1-142.27X2X2-34.84X3X3

式中,Y為固定化酶活力,U/g;X1為加酶量,mL;X2為戊二醛濃度,%;X3為固定化溫度,℃。

全模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示,模型F值為13.23,整體模型的概率(Pr>F)值<0.01,表明該二次方程模型極顯著,失擬項(xiàng)p=0.827>0.05,差異為不顯著,說明模型擬合度好,實(shí)驗(yàn)誤差較小,可以較好地預(yù)測固定化脂肪酶活力隨各參數(shù)變化的規(guī)律。同時(shí)可以看出X1達(dá)到顯著水平(Pr<0.05),X12和X22達(dá)到極顯著水平(Pr<0.01)。通過方差分析結(jié)果可知,各因素影響固定化脂肪酶的酶活大小依次是加酶量(X1)>戊二醇濃度(X2)>固定化溫度(X3)。

表3 全模型方差分析Table 3 ANOVA(Analysis of Variables)for master model

2.4.3 最佳條件的取得及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 為了求得 X1、X2和X3的最佳取值,對(duì)所得的回歸擬合方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù),并令其為0,得到三元一次方程組,求解此方程組可以得出模型的極值點(diǎn):X1=0.15,X2=0.10,X3=-0.22;即加酶量為8.30mL(酶量166mg)、戊二醛濃度為8.20%、固定化溫度為24℃時(shí),固定化脂肪酶的酶活達(dá)到最大值3440.64U/g。在確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行重復(fù)的5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),固定脂肪酶的平均酶活為(3449±1.55)U/g,與模型預(yù)測值相差為0.28%,說明所建立的模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,此時(shí)蛋白固載量為79.21%,酶活回收率為72.46%。

利用design-expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,繪出各因素交互作用對(duì)酶活影響的響應(yīng)面分析圖和等高線如圖7所示,每個(gè)響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用,此時(shí)第三個(gè)變量保持在最佳水平。由響應(yīng)面分析圖可知響應(yīng)變量Y有最大值,即X1、X2和X3存在極值點(diǎn)。

圖7 各因素交互作用對(duì)酶活影響的 響應(yīng)面分析圖和等高線圖Fig.7 Coutour map and reponse surface analysis graph about the influence of the interaction of various factors on enzyme activity

3 結(jié)論與討論

制備的Fe3O4-SiO2磁性復(fù)合載體粒徑較為均一,呈球狀,分散性良好,載體平均粒徑為300nm左右。

Fe3O4-SiO2載體固定化脂肪酶的最優(yōu)條件:脂肪酶∶載體(g/g)=166∶50,戊二醛濃度8.20%,溫度24℃條件下,固定化4h,固定化脂肪酶平均酶活3449U/g。

用磁性納米Fe3O4-SiO2納米粒子作為固定化脂肪酶的載體,有利于固定化脂肪酶從反應(yīng)體系中分離和回收,操作簡便;利用外部磁場可以控制磁性材料固定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向,替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方式,可減少酶活損失,從而提高固定化酶的使用效率。

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Preparation for Fe3O4-SiO2carrier and optimization of the conditions for lipase immobilized

YI Xiao-sheng1,HU Tie2,FENG chao1,GU zheng-wei1,LI Ji-lie1,*,LI Chang-zhu3

(1.Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees(Central South University of Forestry and Technology),Ministry of Education,Changsha 410004,China;2.Guangzhou Maritime Institute,Guangzhou 510725,China;3.Hunan Academy of Forestry,Changsha 410004,China)

Through co-precipitation and sol-gel method,the Fe3O4-SiO2nanoparticles was prepared. The surface of Fe3O4-SiO2magnetic nanoparticles was modified with amino. Finally,the magnetic nano-composite carrier was obtained. The surface features of the carrier by Scanning electron microscope and Fourier Transform Infrared Spectrometer was described. Through the investigation of the effect of amount of enzyme,concentration of glutaraldehyde,immobilization time and temperature on protein solid load rate and lipase activity,the optimum conditions of lipase immobilization was obtained. Under the condition of the amount of lipase solution(0.02g/mL)was 8.30mL,the concentration of glutaraldehyde was 8.20%,the temperature was 24℃ and the immobilization time was 4h,the obtained immobilized lipase enzyme activity was 3449U/g.

magnetic nanometer composite carrier;Lipase;immobilization

2014-04-02

易笑生(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品生物加工。

*通訊作者:黎繼烈(1959-)，女，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品生物加工。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD22B04)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)01-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.040