蘋果疏除幼果與成熟果多糖成分分析及抗氧化活性研究

竇 姣,郭玉蓉,李 潔,陳瑋琦,張曉瑞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

蘋果疏除幼果與成熟果多糖成分分析及抗氧化活性研究

竇 姣,郭玉蓉*,李 潔,陳瑋琦,張曉瑞

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

蘋果疏除幼果,成熟果,多糖,單糖組成,抗氧化

多糖又稱多聚糖(polysaccharides),由10個(gè)以上單糖殘基通過糖苷鍵連接而成,廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)多糖及其復(fù)合物分子可以參與調(diào)節(jié)許多生命現(xiàn)象,同時(shí)具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種功效。隨著對(duì)多糖生物活性研究的深入及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,消費(fèi)者對(duì)多糖的需求將會(huì)越來越大[3-4]。蘋果多糖是植物多糖的重要種類之一,目前對(duì)蘋果多糖的研究主要集中在利用蘋果加工的主要副產(chǎn)物蘋果渣進(jìn)行提取[5],而對(duì)于沒有食用價(jià)值的蘋果疏除幼果中提取多糖尚未見報(bào)道。

我國已成為世界最大的蘋果生產(chǎn)國,2012年蘋果種植面積約為3330萬畝,面積和產(chǎn)量分別占全球的一半以上。疏花疏果是蘋果生產(chǎn)環(huán)節(jié)必須進(jìn)行的操作,生產(chǎn)中以疏果為主,每畝地約疏除50公斤蘋果幼果,總量達(dá)166萬噸。蘋果幼果營養(yǎng)價(jià)值豐富,農(nóng)藥殘留少(果農(nóng)一般在疏果前不噴農(nóng)藥),其中多酚含量是成熟果實(shí)的10倍[6],同時(shí)還含有豐富的多糖、維生素、礦物質(zhì)等多種功能成分,是一種可資源化利用且附加值較高的植物資源。

本研究主要是從蘋果疏果期的幼果及成熟期果實(shí)榨汁后的果渣中分別提取多糖,并對(duì)蘋果幼果多糖(TYAP)和成熟果多糖(MAP)的單糖組成及抗氧化活性進(jìn)行比較研究,以期開發(fā)新的多糖提取植物資源,并為蘋果多糖的進(jìn)一步研究拓寬了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)選擇陜西省咸陽市禮泉縣蘋果綜合實(shí)驗(yàn)站10年生“長富2號(hào)”蘋果樹,蘋果幼果采自盛花期后第30天同一產(chǎn)地疏除的幼果,單果平均重量5g;成熟果果渣:由陜西師范大學(xué)冷破碎制汁生產(chǎn)線提供;D-甘露糖(Man)、D-核糖(Rib)、L-鼠李糖(Rha)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA)、D-半乳糖醛酸(GalUA)、D-葡萄糖(Glc)、D-木糖(Xyl)、D-半乳糖(Gal)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-巖藻糖(Fuc)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;甲醇、乙腈,均為色譜純;無水乙醇、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸亞鐵銨、鐵氰化鉀、水楊酸、H2O2,均為分析純。

Shimadzu LC-2010A 高效液相色譜儀 日本島津公司;LGJ-18C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;WFJ2100型分光光度計(jì) 尤尼科儀器有限公司上海分公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器廠;PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果多糖的提取制備 蘋果幼果多糖的提取:蘋果幼果→切片→漂燙滅酶1min→55℃干燥→粉碎(過60目篩)→70%乙醇脫除多酚(料液比1∶10,重復(fù)3次)→熱水浸提3次(120min,料液比1∶20,80℃)→上清液濃縮至原體積的1/6→95%乙醇沉淀(4℃,靜置過夜)→離心20min(4000r/min)→沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌2次→sevage法除蛋白→溶解沉淀→透析48h→真空冷凍干燥→蘋果幼果多糖(TYAP)。

成熟果多糖的提取:以成熟果果渣為原料,55℃干燥后提取,其方法同蘋果幼果多糖提取方法,得到成熟果多糖(MAP)。

1.2.2 總糖含量的測定 采用苯酚-硫酸顯色法[7]測定蘋果幼果與成熟果多糖的總糖含量。

1.2.3 單糖組成分析

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取一定量的10種單糖,分別用10%甲醇溶液配成0.1mol/L 的母液。取適量母液稀釋為5個(gè)不同質(zhì)量濃度的單糖溶液,參照何念武等[8]的衍生化方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3.2 蘋果多糖溶液的制備 分別稱取20mg TYAP和MAP粉末溶解于裝有2.0mL 3.0mol/L TFA溶液的安瓿瓶中并密封,于90℃下水解8h后冷卻至室溫,4000r/min 離心5min,上清液濃縮蒸干后加1mL超純水溶解,即得到蘋果多糖的水解液[9]。分別取樣品溶液100μL,按“1.2.3.1所示方法”制備樣品PMP標(biāo)記物。

1.2.3.3 HPLC色譜條件 色譜柱:Venusil C18柱(250mm × 4.6mm ID,5μm),檢測波長為250nm,柱溫為35℃,進(jìn)樣量10μL,流速1.0mL/min。流動(dòng)相A為純乙腈;B由0.45g KH2PO4、0.5mL TEA、100mL乙腈和900mL超純水組成(pH7.5)。梯度洗脫條件為:0～5min,99% B;5～15min,99%～95% B;15～30min,95%～90% B;30～45min,90%～70% B。

1.2.4 抗氧化活性分析

1.2.4.1 對(duì)·OH的清除能力 應(yīng)用Feton體系法測定[10-11],依次配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的TYAP和MAP溶液。分別取1mL各多糖溶液于試管中,依次加入6mmol/L FeSO4溶液1mL,6mmol/L 水楊酸溶液1mL和6mmol/L H2O2溶液1mL,37℃水浴1h,在510nm處測定吸光值。用蒸餾水代替多糖溶液做陰性對(duì)照,用蒸餾水代替H2O2溶液做本底對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次,以VC作對(duì)照,計(jì)算清除率。

清除率(%)=(1-Aj/Ai)×100

式中:Aj為樣品管的吸光值;Ai為對(duì)照管的吸光值。

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A1為樣品管的吸光值;A0為自氧化管的吸光值。

1.2.4.3 對(duì)DPPH·的清除能力 分別配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的TYAP和MAP溶液。移取各濃度的多糖溶液2.0mL于小試管中,分別加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL并搖勻,靜置40min,以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液作空白調(diào)零,在525nm處測定吸光值,每個(gè)處理重復(fù)三次,以VC作對(duì)照,計(jì)算清除率。

式中:A0為未加蘋果多糖DPPH溶液的吸光值;Ai為加蘋果多糖后DPPH溶液的吸光值;Aj為對(duì)應(yīng)多糖溶液自身的吸光值。

1.2.4.4 蘋果多糖總還原力的測定 分別配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的多糖溶液。取1mL多糖溶液,加入2.5mLpH6.6的磷酸鹽緩沖液,再加入2.5mL1%的鐵氰化鉀混勻,50℃水浴20min,立即加入2.5mL10%的TCA終止反應(yīng),4000r/min離心10min。取上清液2.5mL于試管中,先加入2.5mL無水乙醇,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液0.5mL,混勻,以蒸餾水作空白調(diào)零,以VC作對(duì)照,在700nm處測定吸光值[13]。

表1 10種單糖標(biāo)品的HPLC分析結(jié)果及TYAP和MAP單糖的摩爾百分比Table 1 The results of 10 standard monosaccharides based on HPLC and the molar ratio of TYAP and MAP

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“DPS 7.05”統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Excel軟件繪圖制表。不同處理間的數(shù)據(jù)采用多重比較的方法進(jìn)行顯著性分析,顯著水平為 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 YAP和MAP得率及總糖含量的測定

采用熱水浸提法分別從蘋果幼果與成熟果果渣中提取多糖,可以得出:成熟果果渣中的多糖得率為14.53%,顯著(p<0.05)高于蘋果幼果中的多糖含量10.40%,苯酚-硫酸顯色法可以得出所提取的TYAP與MAP的總糖含量分別為64.43%和65.70%,二者差異不顯著。

2.2 YAP和MAP的單糖組成分析

將5個(gè)不同濃度的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)PMP 標(biāo)記后進(jìn)行HPLC 分析,獲得各PMP標(biāo)記單糖的峰面積。以樣品濃度(X)為橫坐標(biāo),待測PMP 標(biāo)記單糖的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1。

TYAP和MAP樣品的HPLC分析結(jié)果見圖1。由圖1可知,10種單糖標(biāo)品和樣品在40min內(nèi)均可以保持很好的基線分離,出峰順序依次為:甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖。根據(jù)各單糖的保留時(shí)間可以確定樣品的單糖組成,通過峰面積可以計(jì)算出各單糖組分的比例[14]。根據(jù)HPLC分析結(jié)果可以得出:TYAP中各單糖的摩爾百分?jǐn)?shù)分別為1.9%、1.05%、3.92%、1.08%、3.28%、10.32%、3.9%、25.55%、46.72%和2.28%,主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖三種單糖構(gòu)成,其摩爾百分?jǐn)?shù)可達(dá)到82.59%;MAP中各單糖的摩爾百分?jǐn)?shù)依次為:0.63%、0.91%、4.37%、1.49%、5.28%、24.07%、10.05%、11.51%、38.73%和2.97%,阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和木糖是構(gòu)成成熟果多糖的主要成分,摩爾百分?jǐn)?shù)可以達(dá)到84.37%。

由表1可以得出,TYAP與MAP的主要單糖組成相同,均為:阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖,但單糖比例相差較大,同時(shí),含量較少的其他單糖也因多糖來源不同存在較大的差異[15-17]。所以,TYAP和MAP的單糖組成存在較大差異。

圖1 PMP衍生化的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms based on precolumn derivatization with PMP注:A:PMP標(biāo)記的10種單糖標(biāo)品的HPLC色譜圖; B:PMP標(biāo)記的TYAP的HPLC色譜圖; C:PMP標(biāo)記的MAP的HPLC色譜圖; 1.D-甘露糖(Man);2.D-核糖(Rib);3.L-鼠李糖(Rha); 4.D-葡萄糖醛酸(GlcUA);5.D-半乳糖醛酸(GalUA); 6.D-葡萄糖(Glc);7.D-木糖(Xyl);8.D-半乳糖(Gal); 9.L-阿拉伯糖(Ara);10.D-巖藻糖(Fuc)。

2.3 TYAP和MAP抗氧化活性的比較研究

2.3.1 TYAP和MAP清除·OH能力的比較 TYAP和MAP清除·OH的能力比較見圖2。由圖2可知:TYAP和MAP均具有清除·OH能力,其清除能力與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān),隨著多糖濃度的增加,TYAP對(duì)·OH的清除能力由12.29%升高到75.67%,而MAP對(duì)·OH的清除能力增加緩慢,僅由5.97%增加到25.04%。在相同濃度水平下,TYAP對(duì)·OH的清除能力顯著高于MAP,但仍顯著低于VC。

圖2 TYAP和MAP清除·OH的能力比較Fig.2 Comparision of the inhibitory capacity to ·OH between TYAP and MAP注:兩種多糖抗氧化活性是否存在差異用標(biāo)記字母法 進(jìn)行標(biāo)記,若不存在差異用相同字母表示,存在差異 則用不同字母表示,如圖中的a和b等,下同。

2.3.2 TYAP和MAP對(duì)DPPH·的清除能力比較 TYAP和MAP清除DPPH·能力的比較見圖3。由圖3可知,TYAP和MAP對(duì)DPPH·的清除能力均隨濃度的升高而增大。在相同濃度水平下,MAP清除DPPH·的能力最弱,顯著低于TYAP和VC,同時(shí),TYAP對(duì)DPPH·的清除能力盡管顯著低于VC,但隨著濃度的升高其清除能力逐步接近于VC。

圖3 TYAP和MAP清除DPPH·的能力比較Fig.3 Comparision of the inhibitory capacity to DPPH· between TYAP and MAP

圖4 TYAP和MAP清除O-2·的能力比較Fig.4 Comparision of the inhibitory capacity to · between TYAP and MAP

2.3.4 TYAP和MAP總還原力的測定 TYAP和MAP的還原力比較見圖5。由圖5可知,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),TYAP和MAP還原力測試混合液的OD值與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,均隨質(zhì)量濃度的升高而增大,但在相同濃度水平下,還原能力依次為:MAP

圖5 TYAP和MAP的還原力測定結(jié)果比較Fig.5 Comparision of the reducing powers between TYAP and MAP

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過從蘋果疏除幼果與成熟果果渣中分別提取多糖類物質(zhì),通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)不同原料所提取的多糖其單糖組成相同,但比例存在較大差異,而且從幼果中提取的多糖類物質(zhì)對(duì)O-2·、DPPH·和·OH的清除能力及還原力均顯著高于從成熟果果渣中提取的多糖,分析其原因可能是因?yàn)樘O果幼果與成熟果處于蘋果生長過程的不同時(shí)期,在蘋果不同的生長時(shí)期,果實(shí)中多糖類物質(zhì)的含量及單糖比例必然存在一定的差異[21],而這種差異將不僅表現(xiàn)在多糖的組成和結(jié)構(gòu)等方面,同時(shí)也會(huì)因多糖結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化而表現(xiàn)不同的生物活性,因此,很有必要對(duì)不同生長時(shí)期的蘋果多糖進(jìn)行單獨(dú)研究[15]。本研究結(jié)果表明,TYAP和MAP的單糖組成相同,但比例存在較大差異,這種差異必然導(dǎo)致其多糖結(jié)構(gòu)的不同,這為兩種多糖抗氧化活性的差異奠定了理論基礎(chǔ)。Jia Xuejing[22]等人的研究表明:老鷹茶的單糖組成對(duì)其抗氧化活性有顯著影響,與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。韓苗苗[23]等人對(duì)蘋果梨疏果與成熟果果渣中果膠的理化特性進(jìn)行了比較研究,結(jié)果表明這種特性差異是由果膠物質(zhì)的組分差異引起的,因此,可以證明多糖類物質(zhì)的組分差異對(duì)其理化特性及功能活性均會(huì)產(chǎn)生影響。同時(shí),蘋果幼果處于蘋果生長周期的生育期,其多糖對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、抗病性及抗氧化活性均強(qiáng)于成熟果[24]。

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Composition and antioxidant activity of polysaccharides from thinned-young-apple and matured-apple

DOU Jiao,GUO Yu-rong*,LI Jie,CHEN Wei-qi,ZHANG Xiao-rui

(Shaanxi Normal University,College of Food Engineering and Nutritional Science,Xi’an 710062,China)

thinned-young-apple;matured-apple pomace;polysaccharides;monosaccharide composition;antioxidative activity

2014-03-10

竇姣(1990-)，女，碩士研究生，主要從事功能成分開發(fā)及利用方面的研究。

*通訊作者:郭玉蓉(1962-)，女，博士，教授，主要從事食品生物加工研究。

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金資助(CARS-28)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.015