基于SternVolmer與Tachiya模型分析牛血清白蛋白與花青素的相互作用

宋蘭蘭,周 瑞,景 浩

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

宋蘭蘭,周 瑞,景 浩*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

本文采用了熒光光譜、同步熒光光譜和紫外可見(jiàn)光譜的方法,研究了牛血清白蛋白與花青素在不同溫度(25、30、35℃)水體系中相互作用的光譜學(xué)特征,按照Stern-Volmer和Tachiya模型分析熒光光譜數(shù)據(jù),獲得了二者反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合參數(shù)(結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n),進(jìn)一步分析所得結(jié)合參數(shù)的差異。結(jié)果表明,花青素對(duì)牛血清白蛋白內(nèi)源熒光有猝滅作用且屬于靜態(tài)猝滅。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS的數(shù)值確定它們之間的作用力主要是靜電引力。同步熒光光譜顯示花青素的加入引起色氨酸熒光峰波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移,表明二者結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。根據(jù)Stern-Volmer得出的Ka隨溫度的升高而降低、n卻不受溫度的影響,由Tachiya得出的Ka、n均會(huì)隨溫度的升高而增大。由此可知,Stern-Volmer獲得的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎不隨著溫度變化而變化,但由Tachiya得到的實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨溫度的升高而增大,Tachiya模型得到的結(jié)果更符合小分子與生物大分子相互作用的實(shí)際情況。

花青素,牛血清白蛋白,Tachiya模型,Stern-Volmer模型,相互作用

花青素(Anthocyanin,ACN)是由一個(gè)3碳雜環(huán)(C環(huán))連接兩個(gè)芳香環(huán)(A和B環(huán))構(gòu)成的C6-C3-C6碳骨架母核結(jié)構(gòu)(圖1)。由于B環(huán)各碳位上取代基的不同,可將花青素歸為6類(lèi),即飛燕草色素、天竺葵色素、錦葵色素、矢車(chē)菊色素、芍藥色素和牽牛花色素,其中矢車(chē)菊素在自然界中分布最廣[1]。ACN的活潑酚羥基很容易被氧化成醌,因此穩(wěn)定性較差[2]。ACN與乳清蛋白相互作用可使ACN的降解率明顯降低[3]。因此ACN與蛋白分子的相互作用,可以降低自身氧化過(guò)程并提高穩(wěn)定性。

圖1 花青素基本結(jié)構(gòu) Fig.1 Chemical structures of anthocyanin

采用熒光光譜法研究BSA與ACN結(jié)合的相互作用是基于BSA中三個(gè)發(fā)射熒光氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的最大波長(zhǎng)分別為348,303,282nm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中ACN對(duì)BSA熒光光譜的變化,分析得到的熒光強(qiáng)度、發(fā)射峰特征、能量轉(zhuǎn)移等指標(biāo)。通過(guò)理論模型對(duì)這些指標(biāo)參數(shù)的分析,計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、作用力類(lèi)型等信息,從而闡明生物大分子與小分子相互作用的方式[4]。

Stern-Volmer和Tachiya都是用于計(jì)算結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)的常用理論模型,但所得參數(shù)值有可能出現(xiàn)偏差。分別使用這兩種模型計(jì)算了BSA與金絲桃苷相互作用的n,發(fā)現(xiàn)Stern-Volmer計(jì)算的n值與溫度有關(guān),而Tachiya得到的n值卻與溫度無(wú)關(guān)[5]。本文根據(jù)這兩個(gè)公式的理論基礎(chǔ),在水溶液中利用熒光光譜、紫外吸收光譜研究了不同溫度(25、30、35℃)時(shí),BSA與ACN之間相互作用的光譜學(xué)參數(shù),以期為相關(guān)研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白(BSA,Albumin Bovine V)第五組分純度大于98%,分子量67200u,AMRESCO公司。篤斯越桔花青素(ACN,anthocyanin)購(gòu)于大興安嶺華野生物工程有限公司(ACN含量為25%),實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)XAD-7樹(shù)脂柱進(jìn)一步純化,得到ACN含量為35%。

F-7000型熒光光度計(jì) 日本Hitachi公司；XB 220A型電子天平 PrecisaGravimetric AG公司；pHS-3C+型酸度計(jì) 成都市紀(jì)方舟科技有限公司；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；培英THZ-C型恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制BSA和ACN儲(chǔ)備液配制 將BSA和ACN分別溶解于去離子水(dH2O,pH7.4)中,配成1.5×10-4mol/L和1.5×10-3mol/L的BSA和ACN儲(chǔ)備液,保存于4℃的冰箱中備用,實(shí)驗(yàn)在4h內(nèi)完成。移取1.0mL BSA儲(chǔ)備溶液于15mL離心管中,再加ACN儲(chǔ)備液,得到ACN與BSA的摩爾濃度比是0、1、2、4、6、8、10、12,并用dH2O(pH7.4)定容至10mL,用渦流振蕩器混勻待用。最終BSA的濃度為1.5×10-5mol/L,ANC的濃度分別是0、1.5×10-5、3×10-5、6×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。以不加ACN的BSA溶液為空白。

1.2.2 紫外光譜和熒光光譜測(cè)定 精確移取3.0mL樣品于石英皿中,在波長(zhǎng)200～380nm范圍內(nèi)掃描其紫外吸收光譜；將樣品分別在(25、30、35℃)水浴箱中保持恒溫,空白為1.5×10-4mol/L的BSA溶液,移取3.0mL樣品于石英皿,測(cè)定熒光光譜的條件如下:激發(fā)波長(zhǎng)280nm,激發(fā)狹縫2.5nm,發(fā)射狹縫5nm。測(cè)定其同步熒光光譜條件如下:分別固定Δλ=15nm和Δλ=60nm。

1.3 Stern-Volmer與Tachiya的計(jì)算

1.3.1 Stern-Volmer;Stern-Volmer 常用于判斷猝滅類(lèi)型,且適合用于計(jì)算靜態(tài)猝滅類(lèi)型中的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。用Stern-Volmer[6]進(jìn)一步對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,闡明ACN與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)等方面:

F0/F=KSV[Q]+1=Kqτ0[Q]+1

式(1)

式中:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強(qiáng)度,KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),[Q]為ACN的濃度,Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù),τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命,生物大分子熒光壽命約10-8s[7]。對(duì)于猝滅過(guò)程中的Ka、n,可由(1)得知

lg[(F0-F)/F]=nlg[Q]+lgKa

式(2)

式中:n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù),[Q]為ACN的濃度,Ka為結(jié)合常數(shù)。

1.3.2 Tachiya;Tachiya等則認(rèn)為一個(gè)熒光體分子上所含有的可以與猝滅劑結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)可能和實(shí)際與熒光體結(jié)合的猝滅劑分子數(shù)不同,并由此得出Tachiya模型公式。利用Tachiya進(jìn)一步對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,闡明ACN與BSA相互作用的結(jié)合模式,包括:結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)等方面[8]。

Tachiya中ACN與BSA之間的吸附與解吸可用下式表示:

Bn+Qaq→Bn+1

式(3)

Bn→Bn+1+Qaq

式(4)

式中,Qaq為猝滅劑分子ACN的濃度；Bn表示結(jié)合了n個(gè)猝滅分子的BSA。如果ACN與BSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)固定值,則ACN的分子數(shù)目遵循二項(xiàng)分布式:

式(5)

式中,BSA中結(jié)合的ACN的平均數(shù)目為nav:

式(6)

式中:K=k1/k2,k1是吸附速率常數(shù),k2是解吸速率常數(shù)。若用[M]表示BSA的濃度,則加入ACN的總濃度[Q]為:

[Q]=nav[M]+[Qaq]

式(7)

聯(lián)立式(6)和式(7)得到:

式(8)

BSA與ACN的能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為:

式(9)

式中：τ0為沒(méi)有ACN存在時(shí)BSA的熒光壽命,r是BSA與ACN的結(jié)合距離,R0為E=50%的臨界距離,此時(shí)熒光強(qiáng)度會(huì)變?yōu)?

式(10)

因此無(wú)論是否存在ACN,二者淬滅熒光強(qiáng)度的比值:

式(11)

其中:[M]、[Q]和F/F0的值可由實(shí)驗(yàn)確定,結(jié)合式(8)和(11),可得出m、Ka和r的值。然而當(dāng)[Q]達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí),F/F0也會(huì)飽和。BSA分子上的所有結(jié)合位點(diǎn)都已被ACN占用,再增加[Q]也不會(huì)增加結(jié)合數(shù),此時(shí)熒光強(qiáng)度會(huì)變?yōu)?

式(12)

另外[Q]極低時(shí),ACN與BSA結(jié)合的平均數(shù)nav很小,結(jié)合(1-8)得到:

式(13)

從而此時(shí)熒光強(qiáng)度為:

式(14)

1.4ANC與BSA相互作用的探討

1.4.1ACN與BSA結(jié)合作用力的類(lèi)型根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可知,蛋白質(zhì)等生物大分子與有機(jī)小分子之間的作用力應(yīng)當(dāng)屬于分子間的弱相互作用,包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等[9]。通過(guò)計(jì)算一些熱力學(xué)參數(shù),如焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能ΔG,可以判斷子蛋白質(zhì)等生物大分子與有機(jī)小分之間的主要作用力。在溫度變化范圍不大時(shí),作用過(guò)程的焓變?chǔ)隨溫度的改變可忽略不計(jì),近似認(rèn)為常數(shù)。相關(guān)公式如下:

ln(K2/K1)=[1/T1-1/T2]ΔH/R

式(15)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

式(16)

可以確定ΔH、ΔS和ΔG的數(shù)值,從而判斷ACN與BSA結(jié)合的作用力類(lèi)型。

1.4.2ACN與BSA相互作用的結(jié)合距離 根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論[10]:

E=1-(F/F0)=R06/(R06+r6)

式(17)

式中:E是ACN與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移效率,F和F0分別為加入和未加入ACN時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度,R0為E=50%時(shí)的臨界距離:

R06=8.8×10-25K2n-4ΦJ

式(18)

式中:K2為偶極空間取向因子,n為介質(zhì)的折射指數(shù),Φ為BSA的熒光量子產(chǎn)率,J為BSA熒光光譜與ACN吸收光譜的重疊積分,可表示為:

式(19)

其中:F(λ)為熒光供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。由此可以確定ACN與BSA相互作用時(shí)的結(jié)合距離r。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACN與BSA相互作用的熒光猝滅光譜

在BSA溶液中加入不同濃度的ACN溶液,隨著ACN濃度的增大,BSA熒光光譜被有規(guī)律的猝滅且熒光峰從340nm紅移到345nm(圖1)。

蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸均有熒光產(chǎn)生,但酪氨酸殘基的熒光較弱,其變化很難觀察到而色氨酸殘基熒光很強(qiáng),因此主要觀察色氨酸的熒光變化。激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí),BSA在343nm有最大發(fā)射波長(zhǎng),而在304nm沒(méi)有熒光峰形成。BSA熒光發(fā)生了猝滅,說(shuō)明BSA分子中色氨酸殘基空間位置發(fā)生了改變；而B(niǎo)SA熒光峰的紅移說(shuō)明色氨酸區(qū)域變得更加親水[11]。ACN屬于水溶性的小分子,可以與親水的側(cè)鏈殘基結(jié)合,因此可以推斷是位于BSA分子表面的色氨酸殘基發(fā)生了位置的改變[12]。

圖1 不同濃度的ACN與BSA的熒光猝滅圖Fig.1 Fluorescencespectra of BSA in the presence of different concentrations of ACN注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:0,1.5×10-5, 3×10-5,6×10-5,9.0×10-5,12.0×10-5, 15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1.T=298K。

2.2 ACN與BSA相互作用的同步熒光光譜

BSA的濃度不變,逐漸增加ACN的濃度,測(cè)定Δλ=15 nm和Δλ=60nm時(shí)的同步熒光光譜(圖2A和2B)。由圖可知,隨著ACN濃度的增加,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度明顯減小,但酪氨酸殘基的熒光峰波長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化(圖2A),表明ACN對(duì)酪氨酸殘基微環(huán)境幾乎沒(méi)有影響；而色氨酸熒光峰波長(zhǎng)發(fā)生了從280nm到278nm的微小藍(lán)移(圖2B),表明色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,并且色氨酸殘基熒光猝滅程度高于酪氨酸殘基,表明ACN與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

在蛋白質(zhì)的同步熒光光譜中,Δλ=15nm時(shí)顯示的是酪氨酸殘基的光譜性質(zhì),Δλ=60nm顯示的是色氨酸殘基的光譜性質(zhì)[13]。蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)的變化與自身所處環(huán)境的極性有關(guān),因此蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化可通過(guò)由最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變來(lái)判斷[14]。

圖2 ACN-BSA的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous scanning fluorescence spectra of ACN-BSA注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:0,1.5×10-5, 3.0×10-5,6.0×10-5,9.0×10-5,12.0×10-5, 15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1. T=302K。

2.3 ACN與BSA結(jié)合作用力的類(lèi)型

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式(15)、(16)可以求得反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能ΔG的數(shù)值(表1),以此判斷ACN與BSA之間的主要作用力類(lèi)型[15]。

表1 不同溫度下ACN與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamics constants of ACN-BSA system at different temperatures

由表1可知,BSA與ACN相互作用時(shí),ΔG<0,ΔS>0,ΔH<0。

結(jié)果表明,ΔG<0,說(shuō)明BSA與ACN的結(jié)合作用是自發(fā)過(guò)程。ΔS>0,ΔH<0,說(shuō)明BSA與ACN分子間主要以靜電引力相互結(jié)合[15]。

2.4 ACN與BSA相互作用的結(jié)合距離

圖3為BSA的熒光光譜和ACN的吸收光譜的重疊圖,根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論公式可以確定J=3.69×10-154cm3·mol-1,R0=3.17nm,E=0.57。進(jìn)一步可以得到r=4.02nm。

當(dāng)供體蛋白的熒光發(fā)射光譜與受體小分子的吸收光譜存在一定程度的重疊,且二者間的結(jié)合距離小于7nm時(shí),二者之間將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,從而供體蛋白發(fā)生熒光猝滅[16]。由于r<7 nm,0.5R0

圖3 ACN的吸收光譜和BSA的熒光光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectrum of Anthocyanin and fluorescence emission spectrum of BSA注:BSA:1.5×10-5mol·L-1, ACN:1.5×10-5 mol·L-1,T=298K。

2.5 不同計(jì)算公式探究ACN與BSA的相互作用

2.5.1 探究熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)KSV根據(jù)Stern-Volmer作出F0/F-[Q]關(guān)系圖并計(jì)算出不同溫度下的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV(圖4和表2)。

圖4 ACN與BSA作用的Stern-Volmer圖Fig.4 Stern-Volmer graph of ACN with BSA at different temperatures注:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強(qiáng)度; [Q]為ACN的濃度:1.5×10-5,3.0×10-5,6.0×10-5, 9.0×10-5,12.0×10-5,15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1。

表2 ACN-BSA的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 2 Stern-Volmer constants of interaction between ACN and BSA

注:BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:1.5×10-5、3.0×10-5、6.0×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。

表3 不同溫度下ACN與BSA作用的n和KaTable 3 Then and Ka of BSA-anthocyanin system at different temperature

注：BSA:1.5×10-5mol·L-1;ACN:1.5×10-5、3.0×10-5、6.0×10-5、9×10-5、12×10-5、15×10-5、18×10-5mol/L。 從表2的數(shù)據(jù)看出,隨著溫度的升高,ACN與BSA相互作用的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV值在減小,表明該猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅[18]。然而Tachiya模型不能對(duì)二者的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行猝滅機(jī)理的研究。

2. 5.2 探究結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及結(jié)合距離r

2.5.2.1 結(jié)合參數(shù)(Ka、n、r)的確定 圖5中直線的斜率即n,截距即lgKa,根據(jù)斜率和截距即可計(jì)算出不同溫度下的Ka(見(jiàn)表3)。

圖5 ACN-BSA體系的 lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]圖Fig.5 Plots of lg[([(F0-F)/F]-lg[Q] for ACN-BSA system at different temperatures注:F0和F分別為BSA和BSA-ACN的熒光強(qiáng)度; [Q]為ACN的濃度:1.5×10-5,3.0×10-5,6.0×10-5, 9.0×10-5,12.0×10-5,15.0×10-5,18.0×10-5mol·L-1。

由表3的數(shù)據(jù)看出,ACN與BSA相互作用的Ka隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)樯邷囟群驛CN與BSA的結(jié)合能力減弱了；而二者的n幾乎不隨溫度的變化而變化,且接近于1,表明ACN與BSA相互作用后形成1∶1的靜態(tài)配合物[19]。

2.5.2.2 結(jié)合參數(shù)(Ka、n、r)的確定 通過(guò)Tachiya模型可知,當(dāng)[Q]足夠低時(shí),F/F0與[Q]成比例,且Ka、r和[M]決定其比例系數(shù)。因此通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)不同[M]值時(shí)的F/F0與[Q]的曲線,可以確定Ka、r的值。

由圖6得到BSA與ACN相互作用的Ka、n如表4所示:

圖6 不同溫度時(shí)的Q-F0/F關(guān)系圖 Fig.6 Curves of F/F0 versus concentration of ACN at different temperatures注:A.298K,B.303K,C.308K。

由表4可知:由Tachiya模型得到的Ka、n均隨溫度的升高而增大。

3 討論

結(jié)果表明,在Stern-Volmer和Tachiya模型得到的r均小于7nm,表明小分子的部分片段能夠插入BSA分子內(nèi)部[20],因此非輻射能量轉(zhuǎn)移是引起熒光猝滅的原因之一。通過(guò)Tachiya計(jì)算所得的Ka隨溫度的升高而增大,而Stern-Volmer得到的Ka隨溫度的升高而降低；Stern-Volmer得到的n幾乎不隨溫度的變化而變化,但Tachiya所得n隨溫度的升高而增大。因此使用兩個(gè)模型計(jì)算所得結(jié)合參數(shù)(Ka、n)有明顯差別。

表4 Tachiya模型得到ACN-BSA相互作用的KaTable 4 The binding parameters of ACN-BSA system by Tachiya model

這主要是Tachiya模型考慮到了理論結(jié)合位點(diǎn)數(shù)m與實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n的差異,當(dāng)猝滅劑濃度[Q]達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí),熒光生物大分子(P)上的所有結(jié)合位點(diǎn)都已被猝滅劑占用,再增加[Q]也不會(huì)增加結(jié)合數(shù)[21]；而當(dāng)[Q]極低時(shí),與 P結(jié)合的平均數(shù)很小,這兩種情況下得到的熒光強(qiáng)度是不同的,而Stern-Volmer則假定m即是小分子實(shí)際結(jié)合在蛋白質(zhì)上的數(shù)量n,只能采用相同的熒光強(qiáng)度,這可能并不符合實(shí)際情況。因此Tachiya模型更符合生物大分子與小分子相互作用的實(shí)際情況[22]。

4 結(jié)論

花青素對(duì)牛血清白蛋白的熒光存在較強(qiáng)的靜態(tài)猝滅作用,靜電引力是其主要作用力,二者的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。根據(jù)Stern-Volmer和Tachiya模型所得結(jié)合距離r均小于7nm,而結(jié)合常數(shù)(Ka、n)與溫度的關(guān)系卻有很大的差異。Stern-Volmer得到的n幾乎不隨溫度的變化而變化,但Tachiya所得n隨溫度的升高而增大。這主要是由于兩種理論模型對(duì)理論結(jié)合位點(diǎn)數(shù)m與實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n進(jìn)行了不同處理分析,Tachiya模型將理論結(jié)合位點(diǎn)數(shù)m與實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n進(jìn)行了區(qū)別比較分析。而Stern-Volmer方程則假定m即是小分子實(shí)際結(jié)合在蛋白質(zhì)上的數(shù)量n,這可能并不符合實(shí)際情況。因此Tachiya模型更符合小分子與生物大分子相互作用的實(shí)際情況。

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Study on the Anthocyanin and Bovine Serum Albumin interactionbased on Stern-Volmer Equation and Tachiya model

SONG Lan-lan,ZHOU Rui,JING Hao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The spectroscopic characteristics of BSA and ACN interaction with the different temperatures(25,30,35℃)in water system was investigated,using the fluorescence,synchronous fluorescence and UVvisible spectroscopy. The thermodynamic and the binding parameters(binding constants,binding distance and number of binding sites)of BSA and ACN interaction under different temperature were obtained from the Tachiya model and Stern-Volmer equation,respectively. The results showed that the intrinsicfluorescence intensity of BSA was quenched by CAN and the quenching type was static quenching. The magnitude of thermodynamic parameters ΔH,ΔS for the interaction at different temperatures indicated that the electrostatic interactions played a main role in the binding of ACN to BSA. The synchronous fluorescence spectra of BSA showed that the maximum absorption wavelength of tryptophan residue shifted toward the short wavelength direction caused by the addition of ACN,indicating that the two binding sites closer to the tryptophan residues. According to Stern-Volmer equation,the binding constant decreased as the temperature increased. The number of binding siteswas not affected by temperature. Based on the Tachiya model,the binding constant and binding sites would increase with the increase of temperature.Therefore,the number of binding sitesis hardlychanges with the temperature obtained by Stern-Volmer,butthe actualnumber of binding sites increased with the increase of temperature obtained by Tachiya. So the Tachiya model could be more in line with the actual situation of the interaction between small molecule and biological macromolecule.

Anthocyanin;Bovine serum albumin;Tachiya model;Stern-Volmer equation;Interaction

2014-04-2

宋蘭蘭(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：蛋白與活性小分子物質(zhì)的相互作用。

*通訊作者:景浩(1957-)，男，博士，教授，研究方向：分子營(yíng)養(yǎng)與食品安全。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171676)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)03-0099-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.012