HPLC法測(cè)定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷含量

徐萬幫 蔣忠軍

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180

HPLC法測(cè)定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷含量

徐萬幫 蔣忠軍

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180

目的：對(duì)靈芝孢子紅景天膠囊中主要活性成分紅景天苷含量進(jìn)行測(cè)定。方法：以紅景天苷為指標(biāo)，采用HPLC法，測(cè)定靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的含量，采用C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；甲醇：水（15∶85）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長275nm；流速為1.0ml／min；進(jìn)樣量10μl。結(jié)果：紅景天苷在0.005～5.4mg／ml濃度范圍內(nèi)峰吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系（R＝1），平均回收率為回收率在97.1%～108.9%。結(jié)論：本方法簡便可行，準(zhǔn)確可靠，可用于制劑的質(zhì)量控制。

紅景天苷；高效液相色譜法；高效液相色譜法；含量

靈芝孢子（Ganoderma lucidium spore）是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的孢子，富含多糖，三萜類化合物，維生素C、E，胡蘿卜素等多種生理活性物質(zhì)，具有抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。紅景天則含有苷類、黃酮類、香豆素類、氨基酸類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗輻射、提高缺氧耐受力、緩解體力疲勞、抗氧化等作用。靈芝孢子紅景天膠囊是以靈芝孢子粉、靈芝提取物、紅景天提取物、淀粉、葡萄籽等為主要原料制成的保健食品［2］。隨著人民生活水平的日益提高，對(duì)保健食品的需求在未來一段時(shí)間內(nèi)都會(huì)持續(xù)增長，目前國內(nèi)有少量企業(yè)生產(chǎn)靈芝孢子紅景天膠囊，為了更好的控制該膠囊的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以香港某公司提供的靈芝孢子紅景天膠囊為基礎(chǔ)，以紅景天苷為質(zhì)量指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定紅景天苷來檢測(cè)靈芝孢子紅景天膠囊中主要成分紅景天的含量［3－5］，以期為靈芝孢子紅景天膠囊的質(zhì)量控制提供了有效地技術(shù)支持。

1 儀器和試藥

實(shí)驗(yàn)儀器：美國安捷倫1200液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器等）；試藥：靈芝孢子紅景天膠囊 （香港某公司，批號(hào)為20130901～3）；紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)為110818－201005，由中檢所提供）。甲醇購自默克公司，色譜純，其他試劑為分析純，去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 提取方法的選擇 超聲法：取靈芝孢子紅景天膠囊（批號(hào)20130903）適量，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10ml，稱定重量，超聲處理 （功率120W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，作為供試品溶液。

回流法：取供試品（批號(hào)20130903），按超聲法操作，將“超聲30min”改為“回流30min”，其余同超聲法制備。

取上述兩種溶液，分別取10ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。從表1可以看出，采用超聲法測(cè)定結(jié)果高于采用回流法，這是超聲萃取的效率高于傳統(tǒng)的加熱回流。

表1 不同提取方法的試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.1.2 提取溶劑的選擇 為了獲得最優(yōu)提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)紅景天苷的溶解特性，分別采用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇作為溶劑進(jìn)行提取。取靈芝孢子紅景天膠囊（批號(hào)20130903），照3.1.1法中超聲法，分別用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇進(jìn)行提取制備供試品溶液，分別測(cè)定樣品中紅景天苷的含量。結(jié)果見表2。從表2可以看出甲醇的提取效率高于稀乙醇、水。這是由于紅景天苷更易溶于甲醇。

表2 不同溶劑試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 為了獲得最優(yōu)提取時(shí)間，取靈芝孢子紅景天膠囊（批號(hào)20130903）3份，以甲醇為提取溶劑，按超聲法，分別超聲處理15min，30min，60min，制成供試品溶液，分別測(cè)定紅景天苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 提取時(shí)間對(duì)紅景天苷含量的影響（n＝3）

從表3可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，樣品溶液中的紅景天苷濃度緩慢增加，到30min左右達(dá)到峰值，隨后逐漸降低?？赡茉蚴浅?5min時(shí)樣品中紅景天苷提取不完全。在超聲30min到達(dá)峰值后，繼續(xù)超聲提取，導(dǎo)致紅景天苷分解。因此選擇30min作為本品提取時(shí)間。

綜上，靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的最佳提取方法為：取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥過夜的紅景天苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含5mg的溶液，其他濃度的對(duì)照溶液，采用稀釋法稀釋制備，各濃度對(duì)照溶液冷藏，備用。

2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；紫外檢測(cè)器，以甲醇－水（15∶85）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為275nm，流速為1.0ml／min，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μl，以外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.4 方法專屬性 精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10ul，注入HPLC，記錄色譜圖，由色譜圖1－3提示，在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，空白溶劑 （流動(dòng)相）在此峰位置無吸收，對(duì)本品中紅景天苷含量測(cè)定沒有干擾，方法專屬性良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取濃度約為5mg／ml的紅景天苷對(duì)照品溶液100、10ml、2和1μl至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度溶液。分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定方法測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品的濃度（mg／ml）為橫坐標(biāo)（x），測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y＝2817.x－26.86，r＝1。結(jié)果表明，紅景天苷對(duì)照品濃度在0.005～5.4mg／m l之間與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.54mg／ml的紅景天苷對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定紅景天苷峰面積，此時(shí)，紅景天苷峰面積的RSD＝0.18%，表明儀器精密度良好

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一紅景天苷對(duì)照品溶液，分別在0，8，16和24h按上述色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定紅景天苷峰面積，此時(shí)紅景天苷峰面積的RSD＝0.57%，表明紅景天苷對(duì)照品溶液在此條件下穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性 取同一批供試品（批號(hào)20130903）6份，參照上述提取方法，按含量測(cè)定方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，此時(shí)該批號(hào)靈芝孢子紅景天膠囊中紅景天苷的含量為12.97mg／g，RSD＝0.93%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率測(cè)定 取同一批已知含量（批號(hào)20130903）的供試品6份，按照樣品含量的100%將紅景天苷對(duì)照品溶液加入到樣品中，依上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行提取，制備回收溶液，注入高效液相色譜儀，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，共12次，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝2）

2.10 樣品測(cè)定 實(shí)測(cè)樣品3個(gè)，每個(gè)2份，共計(jì)6份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算紅景天苷含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品測(cè)試結(jié)果表

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇為提取劑，用超聲萃取的方法提取靈芝孢子紅景天膠囊中的紅景天苷，提取效率高，具有良好的操作性。采用高效液相色譜法測(cè)定紅景天苷的含量，在紅景天苷含量為0.005～5.4mg／ml之間呈良好的線性關(guān)系，專屬性強(qiáng)，回收率在97.1%～107.0%之間，且操作簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高，為靈芝孢子紅景天膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了技術(shù)支持。

［1］高歌，包海鷹，圖力古爾.納米級(jí)靈芝子實(shí)體粉末和破壁靈芝孢子粉體

外抗腫瘤活性研究［J］.菌物學(xué)報(bào)，2013，32（1）：114－127.

［2］靳榮光，王秋娟，劉繼平，等.紅景天苷治療冠心病相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（2）：213－215.

［3］國家藥典委員會(huì).中國藥典 （一部） ［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［4］李元圓，何玉鈴，張永勛.HPLC法同時(shí)測(cè)定臺(tái)灣市售女貞子中紅景天苷、女貞子苷的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（2）：230－233.

［5］任艷艷，王曉琴，趙文彬，等.不同產(chǎn)地不同采收期薔薇紅景天中紅景天苷的含量測(cè)定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（2）：377－378.

R284.2

B

1007－8517（2015）01－0034－03

2014.10.09）