β-葡萄糖苷酶體外分子改造研究進展

劉 震， 朱秋享， 石賢愛, 2， 彭永輝， 陳蔭楠

(1. 福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116； 2. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室， 福建 福州 350002)

β-葡萄糖苷酶體外分子改造研究進展

劉 震1， 朱秋享1， 石賢愛1, 2， 彭永輝1， 陳蔭楠1

(1. 福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116； 2. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室， 福建 福州 350002)

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要成分之一， 負責纖維素的最終降解， 在畜牧生產(chǎn)、 食品行業(yè)、 能源和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域都有重要應用. 天然來源的β-葡萄糖苷酶表達水平低、 分離純化困難， 阻礙了β-葡萄糖苷酶的進一步應用. 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對β-葡萄糖苷酶進行體外改造， 提高其糖苷水解或者低聚糖苷合成活性， 是β-葡萄糖苷酶研究及應用的趨勢. 就β-葡萄糖苷酶體外分子改造的研究進展及成果進行綜述， 比較不同分子改造策略的特點， 總結(jié)β-葡萄糖苷酶分子改造過程中的一般規(guī)律， 展望β-葡萄糖苷酶分子改造的研究及發(fā)展方向， 為微生物來源的β-葡萄糖苷酶的體外分子改造研究提供參考.

β-葡萄糖苷酶； 定點突變； 定向進化； 半理性設(shè)計

0 引言

β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)可水解β-葡萄糖苷的非還原端并釋放出β-D-葡萄糖和糖基配體. 天然β-葡萄糖苷酶多以同多聚體的形態(tài)發(fā)揮作用， 其中原核生物中以四聚體居多， 真核生物中以二聚體居多.β-葡萄糖苷酶來源十分廣泛， 包括古細菌、 細菌、 真菌、 植物和動物等各類物種[1]， 其中植物來源的天然β-葡萄糖苷酶糖苷水解活性最高， 最適催化溫度較高， 在工業(yè)生產(chǎn)中應用最多， 但科學研究中使用最多的是細菌來源的酶. 原核生物來源的β-葡萄糖苷酶易于獲取但酶活不高， 而真核生物來源的β-葡萄糖苷酶成分復雜， 難以分離純化， 這使得普通的發(fā)酵工藝及提純方法難以獲得較高產(chǎn)量性質(zhì)優(yōu)秀的β-葡萄糖苷酶， 從而大大限制了β-葡萄糖苷酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應用.

體外分子改造可以改變酶的一系列特性， 從而獲得某一酶學性質(zhì)提高的突變體. 目前利用該技術(shù)改善β-葡萄糖苷酶的酶學特性已有較多報道. 雖然對β-葡萄糖苷酶的分子改造取得了許多成果， 但離適合工業(yè)生產(chǎn)的重組酶還有很大差距.

1 β-葡萄糖苷酶的家族信息與功能結(jié)構(gòu)

1.1 β-葡萄糖苷酶的家族分類及進化特征

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)屬于糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families, EC 3.2.1.X)， 該家族包括133個子家族， 共有185個糖苷水解酶成員， 其中β-葡萄糖苷酶分布于GH家族1、 3、 5、 9、 30和116[2-3]中.β-葡萄糖苷酶除了能夠水解β-葡萄糖苷， 還能夠水解β-半乳糖苷， 有些酶甚至能水解木糖苷、 果糖苷等多種糖苷， 此外它還具有直接糖基化和轉(zhuǎn)糖苷活性， 在低聚寡糖和糖苷合成中具有重要作用.

不同來源的β-葡萄糖苷酶， 其序列一致性有很大的差距. 利用MEGA5軟件構(gòu)建不同物種β-葡萄糖苷酶的系統(tǒng)進化樹(見圖 1)， 可以發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列已經(jīng)發(fā)生巨大的變化，β-葡萄糖苷酶的進化距離與物種之間的親緣關(guān)系基本保持一致. 然而， 即使是同源性極低的β-葡萄糖苷酶， 執(zhí)行催化功能的活性中心仍保持了高度的相似性. 通過Uniprot/Align進行多重序列比對， 發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬的β-葡萄糖苷酶蛋白序列有兩個高度保守序列， 靠近N端的-T-L-Y-H-W-D-L-P-和靠近C端的-[IV]-T-E-N-G-(見圖2)， 這對芽孢桿菌屬β-葡萄糖苷酶的人工進化和分子改造具有重要意義.

圖 1 不同物種來源的β-葡萄糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of β-glucosidase from different species

圖2 芽孢桿菌屬β-葡萄糖苷酶的序列比對Fig.2 Sequence alignment of β-glucosidase from Bacillus

1.2 β-葡萄糖苷酶的功能結(jié)構(gòu)及催化機制

不同家族的β-葡萄糖苷酶有不同的蛋白構(gòu)象. 家族l、 5、 30的β-葡萄糖苷酶的主要結(jié)構(gòu)是(α/β)8桶， 該結(jié)構(gòu)是糖苷水解酶家族中最典型的結(jié)構(gòu)域之一， 能夠?qū)Ｒ恍缘卮呋擒真I的水解，β-葡萄糖苷酶的活性中心就處于該結(jié)構(gòu)域中； 家族3的β-葡萄糖苷酶則是由A、 B兩個結(jié)構(gòu)域組成， A區(qū)靠近N端， 內(nèi)有質(zhì)子供體Glu， B區(qū)位于底物結(jié)合口袋， 包括SDWG保守序列， 內(nèi)有親核基團Asp； 家族9的β-葡萄糖苷酶有6個(α/α)螺旋結(jié)構(gòu)； 家族116的β-葡萄糖苷酶是最近才提出的分類[4]， 還未見到該家族的酶三維結(jié)構(gòu)方面的研究報道. 蛋白構(gòu)象的不同， 導致它們的酶學性質(zhì)各異. 家族1的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶與家族1的β-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)十分相似， 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶大多是熱穩(wěn)性酶， 具有極高的耐熱性， 然而多數(shù)家族1的β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性卻不好. 通過文獻報道不難發(fā)現(xiàn)， 兩種酶都具有(α/β)8桶結(jié)構(gòu)域， 但6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)中比β-葡萄糖苷酶有更多的α/β環(huán)結(jié)構(gòu)[5-7]. 表1列出了不同家族β-葡萄糖苷酶的序列信息、 3D結(jié)構(gòu)、 催化機制及其它信息.

表1 β-葡萄糖苷酶的家族分類及其在數(shù)據(jù)庫中的信息統(tǒng)計*

注： *表中數(shù)據(jù)統(tǒng)計截止于2014年5月； -表示在數(shù)據(jù)庫中沒有記錄.

雖然β-葡萄糖苷酶的序列千差萬別， 結(jié)構(gòu)復雜多變， 但對其催化機制的看法還比較統(tǒng)一. 公認的活性位點關(guān)鍵殘基是靠近N端和C端的兩個Glu殘基. 前者作為質(zhì)子供體， 后者作為親核試劑(家族3以Asp為親核試劑). 按照異頭碳在反應前后是否發(fā)生立體構(gòu)型變化， 催化反應分為反轉(zhuǎn)型和保留型兩種機制. 除了家族9是反轉(zhuǎn)型外， 其他家族基本都采用保留型. 兩種催化機制都涉及氧碳鎓正離子過渡態(tài)的形成. 反轉(zhuǎn)型催化采用單取代廣義酸催化機制， 從過渡態(tài)直接釋放α-D-葡萄糖產(chǎn)物； 保留型催化采用雙取代廣義酸催化機制， 從過渡態(tài)形成糖-酶共價中間體(E-S)， 最后釋放β-D-葡萄糖. Withers等[8]利用2, 4-二硝基苯基-2-脫氧-2-氟代糖苷共價標記， 第一次證明了這種共價中間體的存在， 為保留型β-葡萄糖苷酶的催化機制提供了證據(jù).

2 β-葡萄糖苷酶的分子改造

β-葡萄糖苷酶的體外分子改造大體經(jīng)歷了三個階段： ① 理性設(shè)計階段， 其代表是“定點突變”； ② 以“定向進化”技術(shù)主導的非理性設(shè)計階段； ③ 基于序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)信息的半理性設(shè)計階段， 其特點是將理性設(shè)計與定向進化結(jié)合起來.

2.1 定點突變

定點突變是指通過編碼基因的突變對蛋白質(zhì)氨基酸進行替換、 增加或刪除， 獲得性質(zhì)發(fā)生改變的突變體酶.β-葡萄糖苷酶活性中心的關(guān)鍵殘基， 正是通過定點突變技術(shù)確定的. 對土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)β-葡萄糖苷酶活性位點Glu358進行定點突變后， 結(jié)果E358N、 E358Q完全失活， E358D活力比天然酶降低2 500倍， 實驗利用巧妙的安排進一步證明Glu358對底物結(jié)合幾乎沒有影響， 而對過渡態(tài)的穩(wěn)定十分重要， 從而證明了Glu358是該酶的親核試劑[9]. Voorhorst等[10]在研究極端嗜熱的強烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)β-葡萄糖苷酶的過程中， 發(fā)現(xiàn)對Glu372的替換導致酶活降低， 這表明Glu372是這種耐高溫β-葡萄糖苷酶的催化活性中心的關(guān)鍵殘基. 遠古時代的古細菌與進化至今的細菌具有相同的親核催化位點， 這說明β-葡萄糖苷酶親核催化中心殘基在進化過程中具有十分嚴格的保守性.

Liu等[11]從中國南海生物宏基因組中分離到的Bgl1B， 然后進行H184F和L409E突變， H184F的葡萄糖耐受性提高十幾倍； Hansson等[12]將強烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的β-葡萄糖苷酶進行定點突變， 結(jié)果M424K和F426Y兩個突變體的轉(zhuǎn)糖苷酶活有顯著提高. Sun等[13]對來源于海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的熱穩(wěn)性β-葡萄糖苷酶進行定點突變， 突變體的催化效率提高2.2倍. Mackenzie等[14-16]通過對土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)β-葡萄糖苷酶親核試劑Glu358一系列的突變， 最終將該酶的糖苷合成催化效率提高1 350倍， 其被稱為“分子改造糖苷合成酶”. 不過， 由于該酶必須使用氟代糖和芳基糖分別作為糖基供體和受體， 這種分子改造糖苷合成酶始終沒有在功能寡糖的合成中取得廣泛應用.

Lee等[17]在單氨基酸突變的基礎(chǔ)上做了改進， 構(gòu)建了同時含有兩個或三個殘基替換的突變體， 其中突變體P172L/F250A在催化效率和熱穩(wěn)性方面都比單突變體更優(yōu)秀. 這表明了定點突變從單突變體向小型突變體庫的發(fā)展趨勢， 這使定點突變能更有效、 更廣泛地應用在β-葡萄糖苷酶的分子改造中.

2.2 定向進化

定向進化又稱體外分子進化， 它無需知道酶的三維結(jié)構(gòu)及功能機理， 即可通過對編碼基因的隨機突變和基因重組構(gòu)建突變體庫， 再與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合， 最終獲得具有優(yōu)良性質(zhì)的突變體酶. 定向進化彌補了定點突變的主要缺陷， 它不再只是專注于如何產(chǎn)生有效的突變體， 而是把重點放在如何篩選有效的突變體上. 在過去十幾年里， 定向進化展現(xiàn)了其在β-葡萄糖苷酶分子改造中的巨大作用， 部分實例見表2.

表2 利用定向進化技術(shù)成功改造β-葡萄糖苷酶的部分實例

與定點突變的“所變即所得”不同， 定向進化的基本規(guī)則是“所篩即所得”， 定向進化的成功與否就在于篩選龐大的突變體文庫. 定向進化的突變體庫容量可達1012～ 1015， 而實際上篩選10萬個以上克隆子的報道都不多見. 近些年來出現(xiàn)了一些新的篩選方法， 大大提高了β-葡萄糖苷酶突變文庫的篩選通量. Rakic[27]和Kittl[28]在報道中都提到了針對糖苷合成活性定向進化的高通量篩選方法： 融合蛋白共表達的瓊脂平板篩選技術(shù)； 高通量的“化學互補”篩選方法； 基于氫氟酸導致的pH變化的分光光度法； 由Wither改進的熒光激活流式細胞篩選技術(shù)和由Thorson改進的熒光篩選法. David等[29]利用甲基紅來監(jiān)視釋放的氫氟酸導致的pH變化， 成功從嗜熱桿菌β-木糖苷酶突變體(E335G)糖苷合成酶易錯突變體庫， 篩選出了糖苷合成活性提高的隨機突變體. 此外， 還有一些表面展示技術(shù)， 如細胞表面展示、 噬菌體展示、 核糖體展示技術(shù)等[30-31]， 為更高效、 高通量的篩選提供了可能.

對于定向進化技術(shù)， 只要突變體庫足夠大， 就有可能包括各種性質(zhì)發(fā)生變化的突變體， 但是， 突變體庫越龐大就越需要高效、 高通量的篩選方法. 構(gòu)建高質(zhì)量、 功能豐富的小型庫， 可以降低篩選的壓力， 反而可能取得更好的進化結(jié)果. 這種需求也加速了理性設(shè)計與定向進化結(jié)合的進程， 使基于數(shù)據(jù)驅(qū)動與結(jié)構(gòu)信息的半理性設(shè)計開始嶄露頭角.

2.3 半理性設(shè)計

半理性設(shè)計， 也稱為數(shù)據(jù)驅(qū)動設(shè)計， 是最近幾年才提出的一種新蛋白質(zhì)工程策略. 隨著生物信息學的迅猛發(fā)展， 各大數(shù)據(jù)庫中收錄的糖苷酶基因和蛋白信息呈現(xiàn)爆炸式增長， 這些龐大的數(shù)據(jù)催生了基于糖苷酶序列和功能結(jié)構(gòu)信息的新型改造策略， 即糖苷酶的半理性設(shè)計. 其特點是在分析比較各類數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上， 通過一定的計算模擬與預測指導糖苷酶的改造， 側(cè)重于構(gòu)建高質(zhì)量的小型突變體庫， 降低高通量篩選的壓力.

這種“半理性”設(shè)計策略， 通常利用蛋白質(zhì)序列信息， 結(jié)構(gòu)與功能信息， 以及計算機預測算法預選潛在的靶位點， 并限制氨基酸多樣性. 這種專注于特定氨基酸替換的建庫方法， 考慮了進化變異、 拓撲結(jié)構(gòu)約束、 催化機制特征， 來權(quán)衡用哪一種氨基酸進行替代， 這樣雖然大幅降低了庫的大小， 卻可能導致功能更多的庫. 另外， 基于序列和結(jié)構(gòu)的設(shè)計策略， 如QM和MD算法以及機器學習算法， 已經(jīng)成為有效探索關(guān)鍵氨基酸對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性影響的寶貴工具[32]. 這些策略不僅為通過酶的重新設(shè)計改變蛋白質(zhì)的功能提供了幫助， 還為通過酶的從頭設(shè)計創(chuàng)造新的功能奠定了基礎(chǔ).

從實用的角度來看， 半理性蛋白質(zhì)工程可以顯著提高生物催化劑改造的工作效率. 除了不再需要反復突變來獲取所需的表型， 產(chǎn)生高質(zhì)量的小突變庫也可以有效地消除高通量篩選的困難. 最后， 這些設(shè)計策略為預測和合理化實驗數(shù)據(jù)提供了一個知識框架， 使蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域從基于探索轉(zhuǎn)變到基于假說.

現(xiàn)在， 已經(jīng)有多種針對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)優(yōu)化的理性設(shè)計算法， 其中比較突出的是SCHEMA、 ProSAR和ROSETTA[33]. Fox等[34]用ProSAR算法指導了一個細菌鹵代醇脫鹵素酶的定向進化， 使氰化工序的體積產(chǎn)率提高了約4 000倍， 達到了商業(yè)性生物催化工序設(shè)計標準的要求. 目前， 已有利用這些算法指導糖苷酶分子改造的實例[35-36]， 但這些算法還未直接應用于β-葡萄糖苷酶的改造.

3 結(jié)語

到目前為止， 還沒有明確的理論基礎(chǔ)用于指導β-葡萄糖苷酶的改造， 但是從大量的研究事實中可以發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律： ① 導致β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性提高的位點一般遠離活性中心， 充當重要角色的多是位于肽鏈轉(zhuǎn)折點的疏水性芳香殘基； ② 導致水解活性提高的突變位點一般都不是催化活性中心， 而是在底物結(jié)合、 熱穩(wěn)定性、 空間定位等方面有重要作用的關(guān)鍵位點； ③ 對活性中心的突變， 尤其是功能殘基及鄰近殘基的突變， 會提高糖苷合成活性或者改變底物譜.

定點突變技術(shù)從出現(xiàn)至今， 經(jīng)歷不斷的改進， 取得了許多卓越的成就， 隨著新型設(shè)計策略的崛起和發(fā)展， 定點突變將在β-葡萄糖苷酶分子改造中繼續(xù)發(fā)揮重要作用. 定向進化是目前β-葡萄糖苷酶分子改造的主要手段， 出現(xiàn)于理性設(shè)計之后， 但取得了更加豐碩的成果. 定向進化允許構(gòu)建超大容量的突變體庫， 但它沒有突破篩選瓶頸， 嚴重阻礙了自身發(fā)展. 如果說理性設(shè)計以獲取突變體見長， 非理性設(shè)計以篩選見長， 那么半理性設(shè)計則是融合了這兩種策略的長處， 將成為未來β-葡萄糖苷酶分子改造的重要手段. 一方面， 隨著基因技術(shù)、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息學的發(fā)展， 完全有可能設(shè)計并構(gòu)建出功能更全的小突變體庫； 另一方面， 隨著高通量篩選技術(shù)的迅速發(fā)展， 快速高效地進行大規(guī)模篩選也有可能實現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶的體外分子改造充滿希望.

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(責任編輯： 洪江星)

Development in molecular modification ofβ-glucosidaseinvitro

LIU Zhen1， ZHU Qiuxiang1， SHI Xian’ai1, 2， PENG Yonghui1， CHEN Yinnan1

(1. College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;2. Fujian Key Lab of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Beta-glucosidases are the important members of cellulases, which are responsible for the final step in natural degradation of cellulose. They are widely applied in livestock industry, food industry, as well as energy, health and other fields. However, the low expression level or difficult to separate and purify ofβ-glucosidase, seriously impeded the nativeβ-glucosidase for further applications. Using protein engineering techniques to modify the enzymeinvitroand subsequently to obtain some excellent qualities, especially in improving the glucoside hydrolytic activity or oligosaccharide synthesis activity, is the trends in the study ofβ-glucosidase. This paper make an overview on the researches and achievements in molecular modificationinvitroofβ-glucosidase. The characteristics of different molecular modification strategies and summarize the general laws inβ-glucosidase molecular modification process are compared. Research and development needs are outlooked. This summarization provides reference to studies of microbialβ-glucosidase molecular modificationinvitro.

β-glucosidase； site-directed mutagenesis； directed evolution； semi-rational design

10.7631/issn.1000-2243.2015.04.0565

1000-2243(2015)04-0565-07

2014-05-09

石賢愛(1971- )， 博士， 教授， 主要從事酶定向進化與改造、 生物催化與生物轉(zhuǎn)化及生物活性物質(zhì)分離與表征等方面的研究， shixa@fzu.edu.cn

國家海洋公益性行業(yè)科研專項子課題(201205022-3)； 福建省科技重大專項資助項目(2013NZ0003)

Q816

A