外周血T細(xì)胞亞群及IL-17、IL-10在原發(fā)性干燥綜合征的表達(dá)*

牛廣華,張藝凡,高玉潔,嚴(yán) 峰(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，沈陽 110032)

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·論 著·

外周血T細(xì)胞亞群及IL-17、IL-10在原發(fā)性干燥綜合征的表達(dá)*

牛廣華,張藝凡,高玉潔△,嚴(yán) 峰(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，沈陽 110032)

目的 研究外周血T細(xì)胞亞群及IL-17、IL-10在原發(fā)性干燥綜合征(pSS)患者中的表達(dá)。方法 選取該院風(fēng)濕科門診或住院診斷的pSS患者89例，健康對(duì)照組選自該院健康體檢者38例，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群及ELISA檢驗(yàn)血清中的IL-17、IL-10表達(dá)水平。結(jié)果 外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果顯示，pSS患者CD3+與健康人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD4+較健康人明顯下降(P<0.05)；CD8+較健康人極明顯升高(P<0.05)；CD4+/CD8+較健康人極明顯下降(P<0.05)；細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-17水平較健康人明顯升高(P<0.05)；IL-10水平較健康人極明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 pSS患者較健康人存在明顯的T細(xì)胞免疫異常，患者自身存在炎性反應(yīng)及缺乏對(duì)炎性反應(yīng)的抑制功能。

原發(fā)性干燥綜合征； T細(xì)胞亞群； 白細(xì)胞介素-17； 白細(xì)胞介素-10

干燥綜合征又名舍格倫綜合征(SS)，是一個(gè)主要侵犯外分泌腺體，表現(xiàn)以口干、咽干等癥狀為特征的自身免疫性疾病。本病可分為原發(fā)性干燥綜合征(pSS)和繼發(fā)性干燥綜合征(sSS)兩種。pSS在我國人群患病率為0.3%～0.7%，目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其中細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制是研究的熱點(diǎn)[1]。白細(xì)胞介素(IL)-17主要由近期新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞分泌，已知Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-17F和IL-6、IL-21、IL-22、TNF-α等多種細(xì)胞因子。IL-17作為目前新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)白細(xì)胞的遷移和活化，從而加重炎性反應(yīng)。一些研究顯示，Th17細(xì)胞與干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、炎性腸病等疾病的發(fā)病有關(guān)[2-4]。IL-10是一種抑制性細(xì)胞因子，由Treg細(xì)胞——目前已知的具有抗炎作用的CD4+T細(xì)胞亞群產(chǎn)生，IL-10在移植免疫及微生物感染中起著重要的抑制作用。本文旨在研究IL-17、IL-10、T淋巴細(xì)胞亞群在pSS中的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討pSS的發(fā)病機(jī)制，為其提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照2002年修訂的干燥綜合征國際診斷(分類)標(biāo)準(zhǔn)[5]，選擇2013年8月至2014年8月于遼寧中醫(yī)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科門診或住院診斷的pSS患者89例，其中女80例，男9例；年齡22～68歲，平均(51.05±12.23)歲；病程最短3個(gè)月，最長(zhǎng)11年，平均(5.3±2.16)年。健康對(duì)照組選自本院女性健康體檢者38例，年齡30～72歲，平均為(55.30±13.33)歲。除去試驗(yàn)前接受有關(guān)藥物治療(如激素或免疫抑制劑)的患者。

1.2 儀器與試劑 儀器采用美國BD公司BD FACSCalibur全自動(dòng)流式細(xì)胞儀;美國BIORAD680酶標(biāo)儀。外周血T細(xì)胞亞群分析試劑盒，美國BD Bioscience 生產(chǎn)，批號(hào)90885；IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào)L140218305；IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號(hào)L140218300。

1.3 方法

1.3.1 外周血標(biāo)本采集 晨空腹取靜脈血3 mL于EDTA-K2真空抗凝采血管中，用于檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群；同時(shí)晨空腹取靜脈血4 mL于真空促凝采血管，3 000 r/min離心10 min后分離血清,-80 ℃冰箱保存進(jìn)行IL-17、IL-10批量檢測(cè)。

1.3.2 外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè) 分別加入試劑A(含鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC/CD45-PerCP)5 μL于試管內(nèi)，再加入25 μL全血，震蕩混勻，避光溫育10 min；再加入預(yù)先10倍稀釋的溶血素300 μL，室溫避光放置5 min,待全血溶為紅色透明即可上機(jī)；上機(jī)測(cè)試，存盤后用CELLQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 ELISA檢測(cè)血清中IL-17、IL-10水平 取上述凍存的血清，采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)IL-17、IL-10,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。用美國BIORAD680酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔的吸光度,所測(cè)OD值減除空白值，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值用curveExpert 1.3軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品OD值分別計(jì)算出該患者的IL-17、IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1 pSS患者和健康對(duì)照組外周血中T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與健康對(duì)照組比較，pSS外周血CD4+明顯下降(P<0.05)；CD8+極明顯升高(P<0.05)；CD4+/CD8+極明顯下降(P<0.05)；CD3+差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見表1及見圖1、2。

2.2 pSS患者及健康對(duì)照組血清IL-17、IL-10的表達(dá) 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與健康對(duì)照組比較，pSS血清中IL-17水平明顯升高(P<0.05)；而IL-10水平極明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 pSS患者和健康對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞 亞群表達(dá)水平

圖1 pSS外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)分析

圖2 健康人外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)分析

組別nIL?17IL?10pSS組8937．61±14．4722．24±6．89對(duì)照組3810．04±2．7139．86±10．13P0．0570．000

3 討 論

pSS是一種慢性炎性反應(yīng)疾病。對(duì)本病的治療因暫無有效方法，大多是采用替代治療及對(duì)癥治療，針對(duì)因免疫反應(yīng)導(dǎo)致的組織器官損害，起到控制或延緩的作用。而對(duì)pSS發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究將有利于探索本病新的治療靶點(diǎn)[4]。

目前對(duì)pSS的研究中，以免疫學(xué)和分子生物學(xué)角度研究較多。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，T細(xì)胞參與了pSS的組織損傷過程。T細(xì)胞作為人體重要的免疫細(xì)胞之一，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，輔助體液免疫。根據(jù)細(xì)胞表型的不同分為 CD3+CD4+CD8-T細(xì)胞(即CD4+T細(xì)胞)，CD3+CD4-CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(即CD8+T細(xì)胞)，CD4+T細(xì)胞又可分為炎性細(xì)胞(Th1、Th17)、輔助性細(xì)胞(Th2)和抑制性細(xì)胞(Treg)。而細(xì)胞免疫有兩種形式：一種是CD8+CTL介導(dǎo)的特異性殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)；另一種是CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎性反應(yīng)。本試驗(yàn)的pSS患者外周血CD3+T細(xì)胞總數(shù)與健康對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但T細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞明顯下降，CD8+T細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P<0.05)，CD4+/CD8+也明顯較健康對(duì)照組低(P<0.05)，表明pSS患者存在T細(xì)胞免疫功能異常。這與李昕等[6]、武加標(biāo)等[7]的研究結(jié)果相一致。

IL-17是一種主要由Th17產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其促炎作用毋庸置疑，而沒有其他冗余功能。它可以清除體內(nèi)病原體而引發(fā)炎性反應(yīng)，其數(shù)量的多少一定程度上可以反映Th17細(xì)胞的數(shù)量或功能。Wong等[8]研究顯示，與對(duì)照組比較，SLE患者分泌IL-17A的Th17細(xì)胞數(shù)量明顯增高，患者血漿中IL-17、IL-23、Th17水平也明顯增高，并且IL-17水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性指數(shù)呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，SS患者唇腺組織中有IL-17表達(dá)，且在少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組中表達(dá)的比例顯著高于多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)組，認(rèn)為IL-17可能在pSS疾病發(fā)生淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的早期起著重要的作用[9]。孟潔等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-17對(duì)B細(xì)胞功能異?？赡苡袇f(xié)同作用，而導(dǎo)致pSS局部炎性反應(yīng)的損傷過程。作者的研究結(jié)果顯示，pSS患者血清IL-17較健康對(duì)照組顯著升高,進(jìn)一步提示IL-17可能參與了pSS的發(fā)病過程。

IL-10作為具有抑制炎性反應(yīng)作用的細(xì)胞因子，其抑制作用可解釋為它抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如樹突細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF,并且下調(diào)抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體和共刺激分子CD80與CD86，這樣抑制了APC對(duì)T細(xì)胞的抗原提成作用，從而導(dǎo)致后續(xù)的抑制T細(xì)胞的活化，進(jìn)一步影響效應(yīng)T細(xì)胞引發(fā)炎性反應(yīng)的能力[11]。IL-10不僅被許多適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá),包括T細(xì)胞和B細(xì)胞，還可由先天免疫細(xì)胞,包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌。但主要分泌IL-10的是一類CD4+T細(xì)胞亞群——Treg細(xì)胞。研究IL-10的數(shù)量也可間接反映Treg細(xì)胞的情況。本試驗(yàn)結(jié)果pSS患者血清IL-10較健康對(duì)照組顯著下降，顯示其對(duì)IL-17促炎因子不能有效地抑制，從而無法對(duì)本病的慢性炎性反應(yīng)起到抑制作用，最終使病情加重。

pSS是一種復(fù)雜的風(fēng)濕免疫疾病，針對(duì)T細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子的研究，有望為患者帶來新的治療方向。

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Expression of peripheral blood T-lymphocyte subsets,IL-17 and IL-10 in primary Sjogren′s syndrome*

NIUGuang-hua,ZHANGYi-fan,GAOYu-jie△,YANFeng

(ClinicalLaboratoryCenter,AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China)

Objective The research the expression of peripheral blood T-lymphocyte subsets，IL-17 and IL-10 in primary Sjogren′s Syndrome(pSS).Methods 89 patients with pSS diagnosed in the outpatient department of rheumatic disease or the inpatient department of our hospital were selected.And 38 healthy persons undergoing the physical examination were selected as the control group.T-lymphocyte subsets were identified and classified by the flow cytometer.The expression levels of IL-17 and IL-10 in serum were detected by ELISA.Results The results of peripheral blood T-lymphocyte subsets showed that CD3+had no statistical differences between healthy people and pSS patients(P>0.05),the CD4+level in the pSS patients was obviously lower than that in the normal persons(P<0.05),while CD8+was extremely increased compared with the normal healthy persons(P<0.05) and CD4+/CD8+was extremely decreased compared with the normal healthy persons (P<0.05).The results of cytokines showed that the level of IL-17 was significantly increased compared with the healthy persons (P<0.05) and the IL-10 level extremely decreased compared with the normal healthy persons (P<0.05).Conclusion Compared with the healthy persons,the obvious immune abnormality of T-lymphocyte exists in the pSS patients,the patients themselves exist the inflammatory reaction and lack the inhibitory ability to inflammatory reaction.

primary Sjogren′s syndrome； T-lymphocyte subsets； interleukin-17； interleukin-10

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014020049)。

牛廣華，男，博士，主任技師，從事臨床免疫學(xué)、自身免疫疾病的研究?！?/p>

E-mail:jie_54@sohu.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.007

A

1672-9455(2015)18-2664-02

2015-04-20

2015-05-15)