涼血通瘀方對大鼠腦出血腦組織含水量及AQP-4表達(dá)的影響

李建軍，馬鐵柱，梁 晉，孫世中，王 震

涼血通瘀方對大鼠腦出血腦組織含水量及AQP-4表達(dá)的影響

李建軍1,2，馬鐵柱1，梁 晉1，孫世中1，王 震3*

目的 探討涼血通瘀方對腦出血后腦水腫組織含水量及AQP-4表達(dá)的影響。方法 采用自體尾狀核內(nèi)注射方法制備大鼠腦出血模型。大鼠分為涼血通瘀方治療組、腦出血模型組和假手術(shù)組。涼血通瘀方治療組采用涼血通瘀方灌胃，其余組采用生理鹽水灌胃。分別觀察腦出血后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量。免疫熒光法及聚合酶鏈反應(yīng)監(jiān)測腦水腫組織AQP-4蛋白、AQP-4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 涼血通瘀方治療組和腦出血組在不同時間段內(nèi)神經(jīng)功能缺損均高于對照組，其腦組織含水量也高于對照組(P<0.05)。與腦出血組相比較，涼血通瘀方治療組在腦出血后2、3、5 d時，AQP-4表達(dá)顯著降低，在3、5 d后，大鼠AQP-4 mRNA表達(dá)顯著降低。結(jié)論 涼血通瘀方能夠降低腦水腫組織AQP-4的表達(dá)，從而減輕腦水腫。

腦水腫；涼血通瘀方；AQP-4

0 引言

腦出血是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)。腦出血后腦水腫是影響腦出血預(yù)后的關(guān)鍵因素。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)屬于高度選擇性水通道特異蛋白家族，研究表明，水通道蛋白-4(AQP-4)是一類廣泛分布于毛細(xì)血管周圍星型膠質(zhì)細(xì)胞足突的跨膜水通道蛋白，其在調(diào)節(jié)腦組織水的代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能與腦水腫的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥涼血通瘀方對減輕腦水腫具有明顯的作用[2]。本研究觀察涼血通瘀方對大鼠腦出血腦組織含水量及AQP-4表達(dá)的影響，從而為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠60只，鼠齡12～16周，體重250～300 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。在實驗前飼養(yǎng)大鼠1周，使大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham-operated,SO)、腦出血模型組(Intracerebral henorrhage,ICH)和涼血通瘀方治療組(Liangxue Tongyu Formula,LXTYF)。各組分別在腦出血手術(shù)后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。在評分結(jié)束后處死大鼠，留取標(biāo)本。模型建造后，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分判斷是否成功，若造模不成功則增補(bǔ)相應(yīng)大鼠。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 涼血通瘀方由水牛角、熟地黃、赤芍、生地黃、牡丹皮煎制、濃縮，每毫升藥含量為1.2 g(由天津中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室制備)。

1.2.2 試劑 大鼠單克隆抗體AQP-4系Santa Cruz公司產(chǎn)品，二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒系購自天津優(yōu)抗有限公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒均購自TaKaRa寶生物工程(天津)有限公司。

1.3 動物模型制作 參照文獻(xiàn)[3]制備動物模型，大鼠飼養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。用10%的水合氯醛按400 mg/kg腹腔麻醉后，俯臥位于立體定位儀上固定。根據(jù)人衛(wèi)版《大鼠腦立體定位圖譜》[4]，頭頂常規(guī)備皮，消毒，正中切口約10 mm，用30%H2O2腐蝕顱骨外膜，暴露前囟及冠狀縫，于冠狀縫前0.2 mm、中線向左旁開3 mm處，用手術(shù)刀片尖端處刻深達(dá)硬腦膜的1個小孔。斷尾取自體血約50 μL。用微量注射器自鉆孔處垂直進(jìn)針，深度5.8 mm，勻速向尾狀核內(nèi)緩慢推注，速度約為2 μL/min。注完后停針約15 min后退針，鉆孔處用骨蠟封閉，消毒并縫合切口。假手術(shù)組制備上述模型，在鉆孔處注入30 μL生理鹽水。實驗后，各組動物自由進(jìn)食食物和水，在相應(yīng)時間點(diǎn)處死動物。神經(jīng)功能評分用Longa評分法[5]，按不同分級記分：0級：無體征，記0分；1級：小鼠不能完全伸直其前肢，記1分；2級：小鼠一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分；3級：小鼠不能站立或打滾，記3分；4級：無自發(fā)性活動，有意識障礙記4分。

1.4 藥物干預(yù) 涼血通瘀方組大鼠造模成功后3 h灌胃，間隔24 h重復(fù)給藥，1、2、3、5 d處死大鼠時分別給藥1、2、3、5次。假手術(shù)組和模型組大鼠按相同方式給予生理鹽水灌胃。

2 評價方法

2.1 測定腦組織含水量 采用干濕質(zhì)量法[6]測量腦組織含水量，用電子天平(精確度0.l mg)分別測量實驗組和對照組相應(yīng)部位腦組織濕重。隨后放入恒溫(100 ℃)干燥箱烘24 h以上，至腦組織重量不再減輕為止，然后測其干重。按腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%，計算腦組織含水量。

2.2 AQP-4免疫組化染色 在相應(yīng)時間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分后處死，切片，隨后將切片預(yù)熱、脫蠟、脫水。腦組織切片脫蠟脫水后，按照試劑盒提供的步驟說明，采用免疫組化法檢測腦組織AQP-4蛋白的表達(dá)。DAB染色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，隨機(jī)選取每只大鼠的1張腦切片，在400倍光鏡下隨機(jī)選取血腫周圍的6個互補(bǔ)重疊的視野，對每個視野的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)檢測AQP-4 mRNA的表達(dá) 50 mg樣品加入TRIzol試劑，提取總RNA。通過基因庫查找基因序列，設(shè)計引物序列。AQP-4引物上游為5′-TGGTTCAGTGCTTCGGCCAC-3′；下游引物序列為5′-CCAGCAGTGAGGTTTCCATG-3′，擴(kuò)增片段為219 bp。β-actinin上游引物為5′-CCACAGTCCATGCCATCACT-3′；下游引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGGTGTTAG-3′，擴(kuò)增片段為430 bp。進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 45 s，退火57 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，末次循環(huán)后72 ℃延伸8 min。內(nèi)參蛋白β-actinin反應(yīng)條件同AQP-4。

3 結(jié)果

3.1 不同組別之間神經(jīng)功能缺損評分比較 涼血通瘀方治療組及腦出血模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。涼血通瘀方治療組大鼠術(shù)后3、5 d神經(jīng)功能缺損評分明顯低于腦出血模型組(P<0.05)。見表1。

3.2 不同組別造模后腦組織含水量比較 涼血通瘀方治療組與假手術(shù)組比較，其在腦出血1、2、3、5 d時腦組織含水量明顯增高(P<0.05)；與腦出血組比較，其腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。而與假手術(shù)組比較，腦出血模型組腦組織含水量較高(P<0.05)。見表2。

3.3 不同組別大鼠腦組織AQP-4表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，涼血通瘀方組和腦出血模型組腦組織AQP-4表達(dá)顯著升高，與腦出血模型組比較，涼血通瘀方組在造模2、3、5 d時AQP-4表達(dá)顯著降低，見表3。

表1 三組造模后不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較(分)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與腦出血模型組比較，P<0.05

表2 三組造模后不同時間腦組織含水量測定(%)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與腦出血模型組比較，P<0.05

表3 三組大鼠造模后腦組織AQP-4表達(dá)比較(個/HP)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與腦出血模型組比較，P<0.05

3.4 三組大鼠AQP-4 mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，腦出血模型組和涼血通瘀方組AQP-4 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，造模后3、5 d，涼血通瘀方組低于腦出血模型組(P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠不同時間AQP-4 mRNA表達(dá)(個/HP)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與腦出血模型組比較，P<0.05

4 討論

腦水腫是腦出血后疾病進(jìn)展致死的主要原因之一[7]，腦水腫主要是由于腦組織內(nèi)液體含量過多，導(dǎo)致腦容積增大從而產(chǎn)生一系列生理病理變化。研究發(fā)現(xiàn)，腦水腫與AQP-4密切相關(guān)[8]。AQP-4能夠促進(jìn)血管源性腦水腫中多余水分的再吸收，從而降低血管源性腦水腫的發(fā)生[9]。以往的研究顯示，中藥對于腦水腫改善起重要作用[10-11]。中藥可能降低AQP-4的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)及促進(jìn)腦水腫恢復(fù)。

涼血通瘀方是著名老中醫(yī)周仲瑛教授基于長期臨床實踐經(jīng)驗總結(jié)出的治療出血性疾病急性期的基本方法。瘀熱阻竅是出血性疾病中風(fēng)期的基本病機(jī)。而涼血通瘀方具有涼血化瘀、通腑泄熱的功效，能夠針對瘀熱阻竅起作用。何春燕等[12]研究顯示，涼血通瘀方可以通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1來抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)水平，從而減輕大鼠腦水腫。

本研究顯示，涼血通瘀方治療大鼠腦水腫具有明顯效果，治療后大鼠神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕，腦組織含水量也明顯降低。通過免疫組化和聚合酶鏈反應(yīng)監(jiān)測腦水腫組織AQP-4的表達(dá)，顯示經(jīng)過涼血通瘀方治療的大鼠AQP-4表達(dá)顯著降低，提示涼血通瘀方可能通過降低AQP-4的表達(dá)，從而減輕腦組織水腫。

[1] Manley GT,Fujimura M,Ma T,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].Nat Med,2000,6(2):159-163.

[2] 金妙文,周仲瑛,吳勉華,等.涼血通淤口服液治療出血性中風(fēng)疾病急性期瘀熱阻竅癥的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2007,14(6):323-327.

[3] Tang Y,Wu P,Su J,et al.Effects of Aquaporin-4 on edema formation following intracerebral hemorrhage[J].Exp Neurol,2010,223(2):485-495.

[4] 包新民,斯舒云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版,1991:26-27.

[5] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery exclusion without cranieectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[6] Yan J,Chen C,Hu Q,et al.The role of p53 in brain edema after 24h of experimental subarachnoid hemorrhage in a rat modle[J].Exp Neurol,2008,214(1):37-46.

[7] Xi G,Keep RF,Hoff JT.Mechanisms of brain injury after intracerebral hemorrhage[J].Lancet Neurol,2006,5(1):53-63.

[8] Oliva AA,Kang Y,Truettner JS.et al.Fluid-percussion brain injury induces changes in aquaporin channel expression[J].Neuroscience,2011,28(180):272-279.

[9] Papadopoubs MC,Manley GT,Krishna S,et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema[J].FASEB J,2004,18(11):1291-1293.

[10]李妍,崔向?qū)?陳澤濤,等.活血化瘀中藥對腦出血大鼠腦組織含水量及AQP-4表達(dá)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(19):153-156.

[11]孫皓,郭富強(qiáng),王多姿,等.中藥補(bǔ)陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2012,25(2):115-118.

[12]何春燕,黃建華,王文健,等.涼血通瘀方對腦出血大鼠腦水腫及基質(zhì)金屬蛋白酶9金屬蛋白酶組織抑制劑1表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2010,8(4):347-351.

Effect of liangxue tongyu foamula on brain edema and AQP-4 expression in rats with intracerebral hemorrhage

LI Jian-jun1,2,MA Tie-zhu1,LIANG Jin1,SUN Shi-zhong1,WANG Zhen3*

(1.Brain Hospital，Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China;2.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Department of Medical Science,Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China)

Objective To investigate the effect of liangxue tongyu foamula on brain edema and AQP-4 expression in rats with intracerebral hemorrhage.Methods Intracerebral hemorrhage was induced by injecting self-blood to the caudate nucleus to form the model rats.The rats were divided into liangxue tongyu foamula treatment group(treatment group),cerebral hemorrhage model group (model group) and control group.Rats in treatment group were intragastrically administered with liangxue tongyu foamula,and the other two groups were intragastrically administered with normal saline lavage.The neural function and the brain water content at 12 h,1 d,2 d,3 d,5 d after cerebral hemorrhage were observed.Cerebral edema AQP-4 mRNA and AQP-4 protein expression levels were monitored using immunofluorescence and polymerase chain reaction.Results Compared with control group,both treatment group and model group showed significant differences in the neurologic deficits and the brain tissue water content(P<0.05).Compared with model group,treatment group showed significant decrease in AQP-4 protein at 2,3,5 d after cerebral hemorrhage,AQP-4 mRNA expression decreased significantly in rats after 3,5 d.Conclusion Liangxue tongyu foamula could decrease the expression of AQP-4 in edema brain of rats with intracerebral hemorrhage,thus alleviate the symptom of brain edema.

Cerebral edema;Liangxue tongyu foamula;AQP-4

2014-08-09

1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津 300162；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)療科，天津 300162

武警部隊后勤科研項目(WJHQ2012-20)；武警后勤學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目(WHTD201306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201504002

*通信作者