黑木耳多糖的止咳化痰藥理作用研究

劉 軍，王 昕

黑木耳多糖的止咳化痰藥理作用研究

劉 軍，王 昕

目的 探討黑木耳多糖(AAP)在氨水致咳小鼠中的止咳化痰作用。方法 將60只小鼠(約6周)隨機分成6組：AAP低、中、高劑量組(劑量分別為50、100、200 mg/kg)，桂龍咳喘寧組(500 mg/kg)，氯化銨組(或可待因組)，空白對照組。比較6組小鼠的咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)、咳嗽抑制率、止咳活性以及酚紅排泌量。結(jié)果 與空白對照組比較，AAP中劑量組和高劑量組小鼠的咳嗽次數(shù)均減少(P<0.05)，咳嗽潛伏期延長(P<0.05)。AAP低、中、高劑量組小鼠的潛伏期(F=10.89，P<0.01)、咳嗽次數(shù)(F=4.192，P=0.026)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AAP高劑量組小鼠的酚紅排泌量明顯高于空白對照組(t=2.695，P=0.015)，而AAP低、中劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 黑木耳多糖有止咳化痰的功效。

黑木耳多糖；止咳化痰；藥理作用

0 引言

多糖的分子量較大，是自然界中含量最為豐富的一種生物聚合物，在細胞膜結(jié)構(gòu)中均有存在，參與各種細胞的生理活動。目前提取到的多糖主要為真菌多糖和植物多糖[1]。真菌多糖存在一定的抗腫瘤活性，同時還具有抗衰老、降血糖等各種藥理活性[2]。黑木耳是一種藥食兼用的真菌，具有潤腸通便、活血、止血等功效[3]。其活性物質(zhì)主要為黑木耳多糖(AAP)。本研究旨在通過提取AAP，研究其在止咳祛痰防治方面的藥理活性。

1 資料與方法

1.1 動物 由長春生物制品研究所提供的6周大小的雌雄小鼠(昆明種)，體重(20±2) g。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號：RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)、分析天平(型號：AL104，梅特勒—托利多儀器公司)、電子天平(型號：YB1201，上海?？惦娮觾x器廠)、鼓風(fēng)干燥器(型號：DHG-92438-2，上海?，攲嶒炘O(shè)備公司)。

1.3 試劑 桂龍咳喘寧膠囊(桂龍藥業(yè)公司，國藥準字：20053135)、氯化銨片(呼和浩特制藥廠，批號：980112)、磷酸可待因(中國醫(yī)藥工業(yè)公司青海制藥廠，批號：20100829)。

1.4 方法

1.4.1 制備黑木耳多糖 將5 g黑木耳子實體粉碎過篩，參照最佳的工藝對黑木耳粗多糖進行提取，與提取液合并、濃縮后，加入95%的乙醇溶液，放于 4 ℃冰箱中過夜，離心后獲得醇沉物，依次用75%、100%的乙醇及丙酮進行濾洗，冷凍干燥，獲取黑木耳粗多糖。

1.4.2 純化黑木耳粗多糖 ①結(jié)合Sevag法與酶法脫蛋白：將1.0 g黑木耳粗多糖與80 mL蒸餾水、稀碳酸鈉少許混勻至pH值為7.8，然后滴加4 mL甲苯、0.16 g胰蛋白酶，于39 ℃下放置48 h，加入適量Sevag溶液使V氯仿∶V正丁醇為4∶1，混勻后靜置，去除下層有機相及中層凝膠，整個操作重復(fù)6次；②小分子去雜質(zhì)：對所得糖溶液進行去離子透析。

1.4.3 測定多糖含量 ①制作標準曲線：精確稱取10 mg葡萄糖于蒸餾水中溶解，獲取葡萄糖的標準溶液(100 μg/mL)，參照表1在10只試管中分別加入試劑，分別與5%的苯酚溶液混合(現(xiàn)配現(xiàn)用)后迅速注入濃硫酸混勻，10 min沸水浴后冷卻，將0號試管中的溶液作為空白對照，采用490 nm的T60分光光度計測定吸光度，以吸光度(C)為縱坐標、糖濃度(A)為橫坐標來繪制糖含量相關(guān)的標準曲線，獲得回歸方程：A=0.020 5 C+0.007 3(R2=0.994 8)。②測定多糖含量的方法：精確稱取10 mg的多糖樣品溶解于蒸餾水中，至100 mL容量瓶中定容。提取樣品糖溶液2 mL于試管內(nèi)，按照①的操作方法，獲得所需的吸光度A值，再參照回歸方程即可得C值，計算后方可獲得多糖含量。多糖含量(%)=C×樣品稀釋倍數(shù)×測定體積/樣品干重×100%；多糖提取率(%)=粗多糖干重×粗多糖中多糖含量/黑木耳子實體干重×100%。

1.4.4 AAP對氨水引咳小鼠的止咳作用 60只小鼠隨機分成6組：AAP低、中、高劑量組(劑量分別為50、100、200 mg/kg)，桂龍咳喘寧組(500 mg/kg)，氯化銨組(或可待因組，30 mg/kg)和空白對照組。以20 mL/kg體積給小鼠分別進行連續(xù)5 d的灌胃給藥，1次/d，給予可待因組和空白對照組小鼠相同體積的溶媒(0.5% CMC-Na)，在最后一次給藥1 h后進行實驗。實驗前0.5 h給可待因組注射磷酸可待因(0.03 g/kg)。在棉球中注入0.2 mL的濃氨水，放入1 L倒扣的鐘罩內(nèi)，隨后將小鼠快速置于鐘罩內(nèi)。觀察小鼠的咳嗽動作(張大嘴，腹肌收縮，有時會有咳嗽聲)，記錄小鼠的咳嗽潛伏期(小鼠放入至出現(xiàn)咳嗽的時間)及在3 min內(nèi)咳嗽的次數(shù)?？人砸种坡?%)=(空白對照組平均咳嗽數(shù)-給藥組平均咳嗽數(shù))/空白對照組平均咳嗽數(shù)×100%；止咳活性(%)=給藥組咳嗽抑制率/可待因組咳嗽抑制率×100%。

1.4.5 AAP對小鼠酚紅排泌反應(yīng)的影響 小鼠分組及灌胃方式同“1.4.4”。開始實驗前12 h內(nèi)禁食不禁水，最后一次給藥0.5 h后，按照10 mL/kg體積注射5%的酚紅溶液于各組小鼠的腹腔內(nèi)。0.5 h后處死，將氣管周圍的組織剝?nèi)?，將甲狀軟骨下至氣管分支處一段氣管剪下放入試管中，注?.1 mL 1 mol/L氫氧化鈉以及2 mL生理鹽水進行充分振蕩，在546 nm處測定上清液的吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 黑木耳多糖的止咳效果 見表1?？人韵嚓P(guān)指標包括咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)、咳嗽抑制率及止咳活性。與空白對照組比較，AAP中劑量組和高劑量組小鼠的咳嗽次數(shù)均減少(P<0.05)，而咳嗽潛伏期延長(P<0.05)；AAP低、中、高劑量組小鼠的潛伏期(F=10.89，P<0.01)、咳嗽次數(shù)(F=4.192，P=0.026)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量組小鼠的潛伏期最短，咳嗽次數(shù)最多；而高劑量組小鼠的潛伏期最長，咳嗽次數(shù)最少。

表1 6組小鼠咳嗽相關(guān)指標比較(n=10)

注：*與空白對照組比較，P<0.05

2.2 黑木耳多糖的化痰效果 6組小鼠的酚紅排泌量比較見表2。結(jié)果表明，AAP高劑量組小鼠的酚紅排泌量明顯高于空白對照組(t=2.695，P=0.015)，而AAP低、中劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 6組小鼠的酚紅排泌量比較

注：*與空白對照組比較

3 討論

真菌多糖類物質(zhì)具有降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗氧化及抗腫瘤等生物活性，被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”[4]。AAP是黑木耳的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的生物活性[5]，但其是否具有止咳化痰的藥理作用，目前還存在爭議。

本研究采用小鼠酚紅排泌法和小鼠氨水引咳法對AAP的止咳祛痰作用進行了一定的研究。選擇中藥和西藥兩種陽性藥分別進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中劑量AAP能明顯降低氨水導(dǎo)致的小鼠咳嗽次數(shù)，止咳活性為31.9%，咳嗽抑制率為17.8%。高劑量的AAP能顯著降低氨水導(dǎo)致的小鼠的咳嗽次數(shù)、延長引咳潛伏期，止咳活性為35.8%，咳嗽抑制率為20.1%。AAP對咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期這兩個鎮(zhèn)咳指標的影響基本一致。高劑量AAP能使小鼠氣管段的酚紅排泌量顯著上升，起重要的化痰作用[6]。

慢、急性支氣管炎急性發(fā)作主要是由于細菌及病毒感染在一定程度上抑制了纖毛細胞活性和肺泡巨噬細胞具有的吞噬功能，從而繼發(fā)細菌感染所引起的疾病，也可由其他化學(xué)和物理刺激引起，從屬于中醫(yī)“痰飲”、“咳嗽”等范疇[7]。中醫(yī)理論認為，外感咳嗽多因六淫之邪犯肺導(dǎo)致。中醫(yī)治療往往采用化痰與鎮(zhèn)咳并行的措施[8-9]。本研究也同時觀察了AAP的祛痰和止咳作用。

將酚紅注入小鼠腹腔，經(jīng)吸收后，部分酚紅被分泌進入氣道，如果氣管分泌液上升時，經(jīng)呼吸道粘膜釋放的酚紅亦上升，因此氣管內(nèi)的酚紅排泌量能作為藥物祛痰作用測定的一項指標，實驗過程中所測的吸光度值越高，酚紅的排泌量越多，說明藥物祛痰的作用越強。本試驗結(jié)果提示AAP高劑量存在化痰的作用[10]。

AAP是一種免疫活性多糖，能對機體的免疫功能進行有效的調(diào)節(jié)，幫助人體祛除“外邪”，進而達到止咳祛痰的目的[11]。當然，AAP是否能作為一種止咳化痰藥物，而得到廣泛的應(yīng)用，還需要進一步的大量研究來證實。

[1] Nguyen TL,Chen J,Hu Y,et al.In vitro antiviral activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J].Carbohydr Polym,2012,90(3):1254-1258.

[2] Nguyen TL,Wang D,Hu Y,et al.Immuno-enhancing activity of sulfated Auricularia auricula polysaccharides[J].Carbohydr Polym,2012,89(4):1117-1122.

[3] Xu S,Xu X,Zhang L.Branching structure and chain conformation of water-soluble glucan extracted from Auricularia auricula-judae[J].J Agric Food Chem,2012,60(13):3498-3506.

[4] 王獻友,陳培云,吳廣臣,等.黑木耳多糖提取及其藥理活性的研究進展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,(5):683-687.

[5] 何彩梅,唐政.黑木耳多糖的提取工藝研究[J].北方園藝,2013,(7):156-158.

[6] Li C,Mao X,Xu B.Pulsed electric field extraction enhanced anti-coagulant effect of fungal polysaccharide from Jew's ear (Auricularia auricula)[J].Phytochem Anal,2013,24(1):36-40.

[7] Ma H,Xu X,Feng L.Responses of antioxidant defenses and membrane damage to drought stress in fruit bodies of Auricularia auricula-judae[J].World J Microbiol Biotechnol,2014,30(1):119-124.

[8] Fan X,Zhou Y,Xiao Y,et al.Cloning and characterization of two allelic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes in Auricularia auricula-judae[J].World J Microbiol Biotechnol,2014,30(1):181-189.

[9] Chen G,Luo YC,Ji BP,et al.Hypocholesterolemic effects of Auricularia auricula ethanol extract in ICR mice fed a cholesterol-enriched diet[J].J Food Sci Technol,2011,48(6):692-698.

[10]Reza MA,Jo WS,Park SC.Comparative antitumor activity of jelly ear culinary-medicinal mushroom,Auricularia auricula-judae (Bull.) J.Schrot.(higher basidiomycetes) extracts against tumor cells in vitro[J].Int J Med Mushrooms,2012,14(4):403-409.

[11]Reza A,Choi MJ,Damte D,et al.Comparative Antitumor Activity of Different Solvent Fractions from an Auricularia auricula-judae Ethanol Extract in P388D1 and Sarcoma 180 Cells[J].Toxicol Res,2011,27(2):77-83.

Pharmacological action on the relieving cough and sputum effect of Auricularia auricula polysaccharide

LIU Jun,WANG Xin

(Department of Pharmacy,Xiangyang Hospital,Hubei University of Medicine,Xiangyang 441000,China)

Objective To study the pharmacological action of relieving cough and sputum of auricularia auricula polysaccharide(AAP) in mice with cough induced by ammonia.Methods The 60 mice (about 6 weeks) were divided into 6 groups: low dose (50 mg/kg) AAP group,middle dose (100 mg/kg) AAP group,high dose (200 mg/kg) AAP group,Guilong Kechuanning capsule (500 mg/kg) group (GK group),Ammonium chloride group (codeine group) and the blank control group (control group).The incubation of cough,frequency of cough,inhibition ratio of cough,antitussive activity and the excretion volume of Phenolsulfonphthalein in 6 groups were compared.Results Compared with control group,the frequency of cough of middle dose AAP group and high dose AAP group decreased (P<0.05),and the incubation of cough was longer(P<0.05).There were significant differences in the frequency of cough and the incubation of cough among the three doses of AAP groups(P<0.05).The excretion volume of phenolsulfonphthalein in high dose AAP group was obviously higher than that of control group,there was no significant difference between the low dose/middle dose AAP groups and control group.Conclusion Auricularia auricula polysaccharide has the effect of relieving cough and reducing sputum.

Auricularia auricula polysaccharide;Relieving cough and sputum;Pharmacological action

2014-05-28

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 襄陽 441000

10.14053/j.cnki.ppcr.201502018