單因素配伍劑量對(duì)經(jīng)方芍藥甘草湯藥效組分的影響

朱廣偉，張貴君，王晶娟，毛 瑩，汪 萌

·藥學(xué)研究·

單因素配伍劑量對(duì)經(jīng)方芍藥甘草湯藥效組分的影響

朱廣偉，張貴君*，王晶娟，毛 瑩，汪 萌

目的 研究中藥經(jīng)方芍藥甘草湯中炙甘草或醋白芍單因素配伍劑量變化對(duì)其藥效組分的影響，為臨床合理用藥和建立中藥藥效組分質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。方法 以單因素配伍劑量的醋白芍和炙甘草為載體，以經(jīng)方芍藥甘草湯作為對(duì)照，按照湯劑制備供試品溶液，采用HPLC-DAD法，三波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定藥效組分氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷-甘草酸(λ=230 nm)、甘草苷-甘草素(λ=276 nm)、異甘草苷-異甘草素(λ=360 nm)的含量。結(jié)果 醋白芍劑量12 g不變時(shí)，其藥效組分氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷的含量隨炙甘草的劑量變化如下(mg/mL，n=3)：炙甘草12 g，醋白芍組分含量為1.90-0.89-3.45-0.53；炙甘草為1、6、9、15、18 g時(shí)，醋白芍組分含量均降低。炙甘草劑量12 g不變時(shí)，其藥效組分甘草酸-甘草苷-甘草素-異甘草苷-異甘草素的含量隨醋白芍的劑量變化如下(mg/mL，n=3)：醋白芍12 g，炙甘草的組分含量為9.06-3.19-0.76-0.77-0.15；醋白芍為1、6、9、15、18 g時(shí)，炙甘草組分含量均降低。結(jié)論 ①炙甘草或醋白芍配伍劑量變化時(shí)，其藥效組分的溶出率與經(jīng)方比較有顯著差異，表明改變中藥的配伍劑量其功效會(huì)產(chǎn)生變化；②醋白芍-炙甘草劑量比越接近1∶1，其相應(yīng)的藥效組分溶出率越高；③醋白芍的4種藥效組分總含量隨炙甘草配伍劑量變化規(guī)律：炙甘草12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g，藥效組分總量為6.77～4.15 mg/mL；④炙甘草的5種藥效組分總含量隨醋白芍配伍劑量變化規(guī)律：醋白芍12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g，藥效組分總量為13.93～10.34 mg/mL；⑤炙甘草劑量對(duì)芍藥甘草湯藥效組分總量的影響大于醋白芍。

芍藥甘草湯；藥效組分；配伍劑量；單因素

0 引言

芍藥甘草湯最早見于漢代張仲景《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第29條，有柔肝舒筋、緩急止痛之功效，是歷代傳承常用中藥。古代醫(yī)家對(duì)芍藥甘草湯的研究較多，藥味或有增減，功效亦各有異同，如：《傷寒論》方：醋白芍、炙甘草12 g∶12 g，止痛；《朱氏集驗(yàn)方》：生白芍、生甘草12 g∶8 g，主治消渴；《朱氏集驗(yàn)方》：赤芍、生甘草12 g∶2 g，治腳弱無力；《醫(yī)門八法》方：生白芍、生甘草12 g∶4 g，治胃氣痛；《魏氏家藏方》：生白芍、炙甘草12 g∶1 g，治濕熱腳氣。

歷代芍藥甘草湯配伍組分、配伍比例不同，其藥用功能也不同，其根源在于藥效組分的差異，配伍決定了藥效組分，而藥效組分最終決定了藥用功能。本研究在中藥藥效組分理論的指導(dǎo)下[1-5]，以單因素配伍劑量的醋白芍和炙甘草為載體，以經(jīng)方芍藥甘草湯作為對(duì)照，按照湯劑制備供試品溶液，采用HPLC-DAD法，三波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定藥效組分氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷-甘草酸(λ=230 nm)、甘草苷-甘草素(λ=276 nm)、異甘草苷-異甘草素(λ=360 nm)的含量，研究中藥經(jīng)方芍藥甘草湯中炙甘草或醋白芍單因素配伍劑量變化對(duì)其藥效組分的影響，旨在揭示配伍劑量與藥效組分的對(duì)應(yīng)性關(guān)系，為臨床合理用藥和建立中藥藥效組分質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動(dòng)進(jìn)樣，HP柱溫箱，HP DAD檢測(cè)器；WRX-1S型BP110S電子分析天平；Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

氧化芍藥苷(含量≥98%，批號(hào)：130317)、芍藥內(nèi)酯苷(含量≥98%，批號(hào)：130518)、芍藥苷(含量≥98%，批號(hào)：130815)、苯甲酰芍藥苷(含量≥98%，批號(hào)：131227)、甘草酸(含量≥98%，批號(hào)：121201)、甘草苷(含量≥98%，批號(hào)：131029)、甘草素(含量≥98%，批號(hào)：121102)、異甘草苷(含量≥98%，批號(hào)：130110)、異甘草素(含量≥98%，批號(hào)：131020)，均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。醋白芍、炙甘草購自河北省安國(guó)路路通中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系張貴君教授鑒定分別為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根、豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。供試品配伍比例及來源見表1。

表1 供試品配伍及來源(g)

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取9種對(duì)照品適量，分別加甲醇配制成含甘草苷1.02 mg/mL、異甘草苷1.03 mg/mL、甘草素1.12 mg/mL、異甘草素1.03 mg/mL、甘草酸1.10 mg/mL、芍藥苷1.06 mg/mL、氧化芍藥苷1.05 mg/mL、苯甲酰芍藥苷1.18 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷1.17 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

依次精密量取以上8種對(duì)照品溶液(甘草酸除外)2.5、1、1、0.1、4.5、1、1、1.5 mL置同一25 mL容量瓶中，再加入11.01 mg的甘草酸對(duì)照品，加甲醇稀釋至刻度，配制成含甘草苷102 μg/mL、異甘草苷41.2 μg/mL、甘草素44.8 μg/mL、異甘草素4.12 μg/mL、甘草酸440 μg/mL、芍藥苷190.8 μg/mL、氧化芍藥苷42 μg/mL、苯甲酰芍藥苷47.2 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷70.2 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于冰箱中，4 ℃保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備 按照表1配伍，稱取各種配置比例的藥材，加10倍量水，先浸泡30 min，再煮沸30 min，過濾分離出煎煮液，最后再加10倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，濃縮成濃度為0.1 g/mL的原藥材溶液，取該濃縮液1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，即得濃度為0.01 g/mL的原藥材溶液，為供試品，進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，5%～10% A；5～12 min，10%～14% A；12～15 min，14%～16% A；15～20 min，16%～18% A；20～25 min，18%～20% A；25～30 min，20%～22% A；30～40 min，22%～25% A；40～50 min，25%～40% A；50～60 min，40%～55% A；60～65 min，55%～5% A。體積流量：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm (氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸)、276 nm (甘草苷、甘草素)、360 nm (異甘草苷、異甘草素)。色譜圖見圖1。

圖1 芍藥甘草湯的HPLC-DAD色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL，分別進(jìn)樣。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 芍藥甘草湯中9個(gè)藥效組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn) 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍藥材，制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次，測(cè)定并計(jì)算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素9個(gè)藥效組分峰面積的RSD值。RSD值分別為1.65%、1.75%、0.58%、1.91%、1.64%、1.20%、1.02%、1.40%、1.28%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍藥材，制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別于配制后0、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素9個(gè)藥效組分峰面積的RSD值。RSD值分別為1.96%、1.19%、1.32%、1.91%、1.53%、1.17%、1.43%、1.43%、1.29%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)配伍藥材，平行制備6批次供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素9個(gè)藥效組分峰面積的RSD值。RSD值分別為1.00%、1.83%、1.84%、2.00%、1.75%、1.56%、0.92%、1.34%、0.96%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的醋白芍∶炙甘草(12 g∶12 g)水煎液1 mL，平行6份，分別精密加入等量對(duì)照品溶液，制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素9個(gè)組分的平均回收率依次為99%、99%、99%、100%、100%、101%、99%、100%、101%，RSD值分別為1.28%、1.32%、2.12%、2.4%、1.18%、2.33%、0.89%、0.53%、2.53%。

2.9 樣品測(cè)定 分別制備3批次供試品，每批供試品連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算各組分含量，結(jié)果見表3、表4，圖2～圖5。

表3 醋白芍劑量變化對(duì)炙甘草藥效組分及組分總量的影響(mg/mL，n=3)

表4 炙甘草劑量變化對(duì)醋白芍藥效組分及組分總量的影響(mg/mL，n=3)

圖2 醋白芍劑量的變化對(duì)炙甘草藥效組分含量的影響

圖4 醋白芍劑量變化率與炙甘草及芍藥甘草湯藥效組分總量變化

圖3 炙甘草劑量的變化對(duì)醋白芍藥效組分含量的影響

圖5 炙甘草劑量變化率與醋白芍及芍藥甘草湯藥效組分總量變化

3 討論與結(jié)論

3.1 醋白芍劑量變化對(duì)炙甘草藥效組分的影響分析 炙甘草劑量不變，醋白芍從1 g增至18 g，炙甘草的藥效組分“甘草酸-甘草苷-甘草素-異甘草苷-異甘草素”的含量發(fā)生明顯變化(圖2)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥效組分含量大小(醋白芍∶炙甘草)依次為：12∶12>9∶12>15∶12>6∶12>18∶12>3∶12>1∶12。

醋白芍劑量(g)變化率為94.44%，炙甘草藥效組分“甘草酸-甘草苷-甘草素-異甘草苷-異甘草素”含量(mg/mL)的變化率(%)為24.90-28.04-24.02-32.71-21.36 (見圖4)，在醋白芍劑量具有較大變化的情況下，炙甘草的藥效組分變化相對(duì)較小。

結(jié)果表明，在炙甘草劑量不變的情況下，單獨(dú)改變醋白芍的劑量，芍藥甘草湯中炙甘草的藥效組分發(fā)生明顯的改變，醋白芍與炙甘草的劑量比越接近1∶1，藥效組分含量越高。

3.2 炙甘草劑量變化對(duì)醋白芍藥效組分的影響分析 醋白芍劑量不變，炙甘草從1 g增至18 g，醋白芍的藥效組分“氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷”的含量也發(fā)生明顯變化(圖3)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥效組分含量大小(醋白芍∶炙甘草)依次為：12∶12>9∶12>15∶12>6∶12>18∶12>3∶12>1∶12，變化規(guī)律與“3.1”項(xiàng)描述相同。

炙甘草劑量(g)變化率為94.44%，醋白芍的藥效組分“氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷”的含量(mg/mL)變化率(%)為40.12-38.77-39.86-26.30-73.21(見圖5)，在炙甘草劑量具有較大變化的情況下，醋白芍的藥效組分變化相對(duì)較大。

結(jié)果表明，在醋白芍劑量不變的情況下，單獨(dú)改變炙甘草的劑量，芍藥甘草湯中醋白芍的藥效組分也發(fā)生明顯改變，醋白芍與炙甘草劑量比越接近1∶1，藥效組分含量越高。 以上變化規(guī)律可能由兩個(gè)原因共同決定：①炙甘草(醋白芍)藥效組分對(duì)醋白芍(炙甘草)藥效組分的化學(xué)性質(zhì)和溶解性有重要影響[6-9]，炙甘草(醋白芍)劑量增減引起湯劑中炙甘草(醋白芍)藥效組分的變化，最終導(dǎo)致芍藥甘草湯中醋白芍(炙甘草)的藥效組分變化；②炙甘草(醋白芍)劑量變化，改變了煎煮時(shí)水的用量，醋白芍(炙甘草)與水的比例越大，表明煎煮時(shí)加水量越少，藥效組分越難溶出，因此藥效組分含量越低，與研究數(shù)據(jù)相吻合。

3.3 醋白芍、炙甘草劑量變化對(duì)9種藥效組分總量的影響分析 醋白芍劑量變化，9種藥效組分的總量分別為：20.76、18.30、17.98、17.22、17.10、13.34、12.93 mg/mL。藥效組分總量大小關(guān)系(醋白芍∶炙甘草)依次為：12∶12>15∶12>9∶12>18∶12>6∶12>3∶12>1∶12。炙甘草劑量變化，9種藥效組分總量分別為：20.72、18.32、17.71、16.55、12.38、7.74、5.55 mg/mL。藥效組分總量大小關(guān)系(醋白芍∶炙甘草)依次為：12∶12>12∶15>12∶18>12∶9>12∶6>12∶3>12∶1。

以上數(shù)據(jù)顯示，醋白芍和炙甘草的劑量變化對(duì)藥效組分總量影響趨勢(shì)基本一致，但炙甘草劑量變化對(duì)組分總量的影響>醋白芍劑量變化對(duì)組分總量的影響，可能是由于炙甘草藥效組分-甘草酸對(duì)其他藥效組分有增溶的作用，當(dāng)炙甘草劑量低時(shí)，湯劑中甘草酸含量低，增溶作用不顯著。

3.4 劑量變化對(duì)醋白芍、炙甘草自身藥效組分影響分析 醋白芍、炙甘草劑量變化對(duì)其自身藥效組分也有影響，配伍中醋白芍或炙甘草的劑量為1、3、6、9、12、15、18 g時(shí)，溶液中醋白芍藥效組分“氧化芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷-芍藥苷-苯甲酰芍藥苷”和炙甘草藥效組分“甘草酸-甘草苷-甘草素-異甘草苷-異甘草素”的含量并沒有倍數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此，復(fù)方中單味藥的劑量與其藥效組分含量沒有線性關(guān)系。

3.5 芍藥甘草湯9種藥效組分的篩選 中藥藥效組分理論認(rèn)為，藥效組分應(yīng)與臨床療效相對(duì)應(yīng)，中藥的配伍可影響藥效組分的溶出，對(duì)中藥的療效有很大影響。氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素均具有一定的解痙[10-12]、鎮(zhèn)痛[10-12]功效。還有研究證實(shí)，甘草酸與芍藥苷配伍，在鎮(zhèn)痛、解痙、解熱、抗炎[13]、抑制胃液分泌和松弛平滑肌方面均有協(xié)同增效作用。甘草酸可與中藥中多種生物堿起化學(xué)反應(yīng)，生成不易溶解的沉淀物，后者在體內(nèi)緩慢分解而逐漸發(fā)揮藥效，使藥性發(fā)作較緩，從而降低不良反應(yīng)的發(fā)生率，同時(shí)，這9種藥效組分均為水溶性成分，符合經(jīng)方水煎的特點(diǎn)。因此，本文以經(jīng)方芍藥甘草湯作為研究對(duì)象，選取了與臨床療效相對(duì)應(yīng)的9種藥效組分作為研究目標(biāo)，探討其藥效組分的變化規(guī)律。

3.6 芍藥甘草湯藥效組分的分析方法篩選 筆者分別應(yīng)用乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.02%磷酸水溶液，流速1、0.8 mL/min，柱溫30、35、40 ℃，對(duì)比研究在上述條件下的分離結(jié)果。結(jié)果顯示，乙腈-0.1%磷酸水溶液、流速1 mL/min、柱溫30 ℃條件下，分離效果最好。

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Influence of compatibility dose with single factor on the active components alignment of classical prescription Shaoyao gancao decoction

ZHU Guang-wei,ZHANG Gui-jun*,WANG Jing-juan,MAO Ying,WANG Meng

(School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

Objective To study the influence of compatibility dose changes of honey-fired licorice and vinegar fired paeoniae on the active components alignment of Shaoyao gancao decoction by single factor analysis,and provide the scientific basis for establishing the quality standard of traditional Chinese medicine and rational drug use.Methods Taking single compatibility dose of honey-fired licorice and vinegar-fired paeoniae as carrier,and classical prescription Shaoyao gancao decoction as control,the content of oxypaeoniflora-albiflorin-paeoniflorin-benzoylpaeoniflorin-glycyrrhizic acid (λ=230 nm),liquiritin-liquiritigenin (λ=276 nm),isoliquiritin-isoliquiritigenin (λ=360 nm) were determined by HPLC-DAD multi wavelength scanning method.Results The contents (oxypaeoniflorin-albiflorin-paeoniflorin-benzoylpaeoniflorin) of vinegar-fired paeoniae (12 g) respectively (mg/mL,n=3) were 1.90-0.89-3.45-0.53 when the dose of honey-fired licorice was 12 g;and the contents of vinegar-fired paeoniae were lower when the the dose of honey-fired licorice was 1,6,9,15,18 g.The contents (glycyrrhizic acid-liquiritin-glycyrrhizin-isoliquiritin-isoliquidritigenin) of honey-fired licorice (12 g) respectively (mg/mL,n=3) were 9.06-3.19-0.76-0.77-0.15 when the dose of vinegar-fired paeoniae was 12 g;and the contents of honey-fired licorice were lower when the the dose of vinegar-fired paeoniae was 1,6,9,15,18 g.Conclusion ①When the compatibility dose of honey-fired licorice and vinegar-fired paeoniae changed,the dissolution rate of the active components was significantly different from that of classical prescription Shaoyao gancao decoction (P<0.05);② The closer the dose ratio of vinegar-fired paeoniae and honey-fired licorice is to 1:1,the higher the the dissolution rate of the active components is;③The total contents (6.77～4.15 mg/mL) of the 4 active components in vinegar-fired paeoniae as the compatibility dose of honey-fired licorice changes: 12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g (honey-fired licorice);④The total contents (13.93～10.34 mg/mL) of the 5 active components in honey-fired licorice as the compatibility dose of vinegar-fired paeoniae changes: 12 g>9 g>15 g>6 g>18 g>3 g>1 g (vinegar-fired paeoniae);⑤The influence of honey-fired licorice on the total contents of active components in Shaoyao gancao decoction is greater than that of vinegar-fired paeoniae.

Shaoyao gancao decoction;Active components alignment;Compatibility dose;Single factor

2014-06-19

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102

中藥新產(chǎn)品開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化及中藥資源保護(hù)利用研究(桂科攻10124008-14)

10.14053/j.cnki.ppcr.201502013

*通信作者