杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究

逯 蕾，姜愛(ài)雯，杜佩珊，班旭霞，劉云寧，梁 江

·論著·

杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究

逯 蕾1，姜愛(ài)雯1，杜佩珊2，班旭霞1，劉云寧1，梁 江1

目的 研究杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡的保護(hù)作用。方法 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果 采用5、10、20 μg/mL濃度的杜鵑素處理細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞活性呈濃度依賴性增加，細(xì)胞存活率提高；與H2O2組相比，細(xì)胞皺縮明顯減少。杜鵑素20 μg/mL可抑制H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。結(jié)論 杜鵑素具有抑制H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

杜鵑素；內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，低密度脂蛋白的氧化產(chǎn)生氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1]，動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后,血小板在該處粘附而聚集，隨后發(fā)生纖維蛋白沉積，形成微血栓，逐漸形成粥樣硬化斑塊。血管緊張素Ⅱ、活性氧炎性細(xì)胞因子和機(jī)械擴(kuò)張等均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[2]，目前認(rèn)為各種因素造成血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)[3]。

杜鵑素(Farrerol)又名法爾杜鵑素，屬于二氫黃酮類化合物，其化學(xué)名為5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)-6,8-二甲基-2,3-二氫苯并吡喃-4-酮，是滿山紅及其他杜鵑屬藥用植物中的一種有效成分[4-5]，現(xiàn)已能人工合成[6-7]。滿山紅(興安杜鵑)的主要藥理作用表現(xiàn)為：對(duì)呼吸系統(tǒng)的作用(包括鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘)，對(duì)心血管系統(tǒng)的作用，鎮(zhèn)痛作用，抗腫瘤，利尿作用等[8]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道杜鵑素有很好的抗菌作用[9]。此外，杜鵑素對(duì)皮膚燙傷性炎癥滲出也有一定的抑制作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)的細(xì)胞試驗(yàn),進(jìn)一步研究杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為此化合物的生物活性提供新的理論基礎(chǔ)，為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的先導(dǎo)化合物。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 HUVEC細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物工程有限公司。杜鵑素購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度>95%；RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、Hoechst 33258、多聚甲醛、H2O2，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自博世德生物有限公司。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Force HP90，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(OPTEC BDS200-PH，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；熒光顯微鏡DFM-20(上海蔡康光學(xué)儀器廠)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Model 680，MICROPLATE READER，Bio-Rad)。

2 方法

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，2～3 d換1次，細(xì)胞在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)杜鵑素細(xì)胞毒性，確定IC50值 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，將其按5×104/mL密度接種于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃孵育24 h；分別加入濃度為10、20、40、80 μg/mL的杜鵑素，作用細(xì)胞24 h，每組設(shè)6個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)立正常組分作為對(duì)照組；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD值)。

2.3 MTT法檢測(cè)杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的保護(hù)作用[11]待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，將其按5×104/mL密度接種于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃孵育24 h；分別加入濃度為5、10、20 μg/mL的杜鵑素，作用細(xì)胞1 h，每組設(shè)6個(gè)平行孔，然后500 μM H2O2作用細(xì)胞1 h；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

2.4 Hoechst 33258染色法觀察給藥前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，將其按5×104/mL孔接種于6孔板，5% CO2、37℃孵育24 h；分別加入濃度為5、10、20 μg/mL的杜鵑素作用細(xì)胞1 h，每組設(shè)3個(gè)平行孔，然后500 μM H2O2作用細(xì)胞1 h；加入Hoechst 33258溶液，使其終濃度為1 mg/mL，4 ℃作用10 min；PBS洗1次，多聚甲醛固定20 min，熒光顯微鏡觀察形態(tài)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測(cè)定杜鵑素細(xì)胞毒性 按log IC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]計(jì)算杜鵑素對(duì)細(xì)胞抑制作用的IC50值，得出IC50=45.2 μg/mL。

3.2 不同濃度杜鵑素對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 在H2O2濃度相同的條件下，細(xì)胞的存活率隨杜鵑素濃度的升高而提高。10、20 μg/mL的杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡的保護(hù)作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞存活率的影響(n=3)

3.3 不同濃度杜鵑素對(duì)H2O2損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 見(jiàn)圖1、圖2。圖中顯示，對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈多角形或短梭形、飽滿、大小一致；模型組的細(xì)胞皺縮變圓，間隙增大；與模型組相比，杜鵑素各劑量組細(xì)胞的形態(tài)均得到不同程度的改善，隨著濃度的提高，細(xì)胞皺縮明顯減少，大部分細(xì)胞飽滿呈多角形或短梭形。

圖1 杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡保護(hù)作用的細(xì)胞形態(tài)

圖2 杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡保護(hù)作用的Hoechst 33258染色

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，活性氧自由基是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因之一[12]。H2O2是機(jī)體產(chǎn)生的活性氧，在過(guò)氧化條件下能分解成氧自由基，通過(guò)對(duì)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。據(jù)此本研究建立了以H2O2為刺激因素的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，研究了杜鵑素對(duì)H2O2損傷的HUVEC的作用。在內(nèi)皮細(xì)胞被H2O2損傷后，給予不同濃度的杜鵑素進(jìn)行保護(hù)，MTT法結(jié)果表明，不同濃度杜鵑素使損傷HUVEC細(xì)胞的存活率顯著提高，且具有劑量相關(guān)性。

近年研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害是心血管疾病早期的重要特征，是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化最重要的始動(dòng)因素[13]，因而尋找抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物是防治心血管疾病的重要思路。本實(shí)驗(yàn)就杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡的保護(hù)作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，杜鵑素對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC的損傷具有一定的保護(hù)作用，為臨床用藥提供理論支持，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Study on protective effect of farrerol on H2O2-induced HUVEC apoptosis

LU Lei1,JIANG Ai-wen1,DU Pei-shan2,BAN Xu-xia1,LIU Yun-ning1,LIANG Jiang1

(1.Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China;2.The First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,China)

Objective To study the protective effect of farrerol on H2O2-induced HUVEC apoptosis.Methods The cell activity was analyzed by MTT assay and morphological changes were observed with phase contrast microscopy and fluorescence microscopy.Results The endothelial cell were treated by 5,10,20 μg/mL of farrerol,after that,the cells’ activity increased in a dose-dependent manner,and the survival rate increased.Compared with H2O2group,the shrinkage of cell in farrerol+ H2O2group reduced significantly.Farrerol 20 μg/mL inhibited the HUVEC apoptosis induced by H2O2.Conclusion Farrerol has potential protective effect on H2O2-induced HUVEC apoptosis.

Farrerol;HUVEC;Apoptosis

2014-06-19

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，河北 張家口 075000；2.張家口市第一醫(yī)院，河北 張家口 075000

10.14053/j.cnki.ppcr.201502001