TLR4/NF-B在國人膝關節(jié) OA關節(jié)軟骨中表達的實驗研究

俞銀賢 陳金偉 阮琪 馬春輝 易誠青*馬金忠

俞銀賢 陳金偉 阮琪 馬春輝 易誠青*馬金忠

目的 通過研究人膝關節(jié)晚期骨性關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）中Toll樣受體4/核因子-B（Toll-like receptor 4/nuclear factor kappaB,TLR4/NF-B）的表達，初步探討自身免疫在OA發(fā)病機制中的作用。方法 選取2013年9月～11月行全膝關節(jié)置換手術的20名膝關節(jié)OA患者（平均年齡68.5歲），取脛骨負重區(qū)及非負重區(qū)軟骨，對照組為12名因創(chuàng)傷性股骨頸骨折行全髖關節(jié)置換術患者（平均年齡66.3歲）的股骨頭負重區(qū)軟骨。采用免疫組化方法分析各組軟骨中TLR4的表達情況；運用RT-PCR和Western Blot技術檢測三組標本軟骨中TLR4、NFBp65的mRNA和蛋白表達。結果 1.免疫組化結果顯示TLR4在負重區(qū)軟骨中表達最高，非負重區(qū)其次，對照組正常軟骨表達最少。2.RT-PCR及Western Blot檢測軟骨中TLR4、NF-B的mRNA及蛋白含量，結果顯示負重區(qū)軟骨同樣表達最高，對照組表達最低，且運用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法分析顯示＜0.05，組間具有統(tǒng)計學差異。結論TLR4/NF-B在OA的軟骨負重區(qū)表達明顯上調，提示TLR4/NF-B信號通路介導的自身免疫可能參與了OA的發(fā)病機制。

骨關節(jié)炎；TLR4；NF-B；軟骨；自身免疫

OA是臨床常見病，危險因素有老齡，女性，肥胖，機械應力及軟骨下骨量差等，但確切發(fā)病機制尚不明確。OA主要累及關節(jié)軟骨，但其他關節(jié)組織如軟骨下骨和滑膜等往往也累及，因此近年來有學者認為OA發(fā)病是涉及到全關節(jié)組織的一種炎癥性疾病，自身免疫炎癥是OA病程中的重要機制[1]，其中TLR4信號通路介導的自身免疫炎癥具有重要研究價值，可能會作為未來改變OA病程的藥物治療靶點[2]。

本研究旨在通過研究國人晚期 OA關節(jié)軟骨中 TLR4/ NF-B的表達，初步探討自身免疫反應在國人OA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗組（A組與B組）：2013年9月～2013年11月，因晚期OA行人工全膝關節(jié)表面置換術的患者20名，其中女性10名，男性2名，年齡56～78歲，平均68.5歲，所有患者術前x線片顯示軟骨均明顯損傷，按照Kellgren-Lawrence（K-L）分級均為III級和IV級。術中發(fā)現(xiàn)軟骨損傷情況負重區(qū)均符合國際軟骨修復協(xié)會軟骨損傷分級系統(tǒng)（ICRS）的IV度，非負重區(qū)為III度。取術中切下的脛骨關節(jié)負重區(qū)及非負重區(qū)軟骨，各取2份分別放置于4%多聚甲醛和-70℃冰箱中保存。對照組為在我院確診為創(chuàng)傷性股骨頸骨折而接受全髖關節(jié)置換治療的患者12名，其中女性8名，男性4名，年齡61～73歲，平均66.3歲，取全髖關節(jié)置換手術中患者股骨頭負重區(qū)軟骨為實驗對照標本，同樣方法保存，大體觀察未見軟骨損傷。所有病例均排除：類風濕關節(jié)炎、SLE等自身免疫疾病，既往髖關節(jié)手術史、髖關節(jié)炎、髖關節(jié)感染、髖關節(jié)畸形、代謝性骨病、下肢不等長、髖關節(jié)腫瘤史等。

1.2 主要實驗儀器

RT-PCR：臺式高速冷凍離心機；LifeexpressThermalCycler PCR儀；SLAN熒光定量PCR儀；SW-CJ-1FD超凈工作臺等。

WesternBlot：752-P紫外分光光度計；TGL-16c臺式離心機；neofuge15R冷凍離心機；DYY-6C電泳儀；TL-420D水浴鍋；V300掃描儀；alphaEaseFC灰度分析軟件。

免疫組化：RM2016切片機；DGX-9003B烘箱；TE2000倒置熒光顯微鏡。

1.3 主要實驗試劑

RT-PCR：Trizol Reagent；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇；RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit；定量PCR試劑盒。

Western Blot：IPA裂解液、PMSF（100mM）、磷酸化蛋白酶抑制劑、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL、顯影定影試劑；BCA蛋白定量檢測試劑盒；TRIS、SDS；甘氨酸；PVDF膜0.45um、PVDF膜0.22um；脫脂奶粉；HRP標記山羊抗兔、HRP標記兔抗山羊、HRP標記兔抗小鼠、HRP標記兔抗大鼠。

1.4 實驗步驟

1.4.1 RT-PCR檢測TLR4、NF-B的mRNA的表達

提取關節(jié)軟骨組織的總RNA，根據試劑盒說明將總RNA的mRNA逆轉錄成cDNA。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠置于凝膠自動成像儀中，采用Gelswork-D軟件分別對實驗組負重區(qū)、非負重區(qū)組和對照組目的基因（TLR4、 NF-B）以及內參照的 -actin的擴增產物進行半定量分析，目的基因mRNA的相對表達量以目的基因光密度值與內參照基因光密度值的比值表示。

1.4.2 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測TLR4、NF-B蛋白表達

蛋白提取和蛋白濃度測定按照試劑盒說明書進行，Western blot按照常規(guī)操作程序進行，轉膜后用5%脫脂奶粉封閉2小時，加入用脫脂奶粉稀釋的山羊抗TLR4多克隆抗體（1：600稀釋），4℃過夜，TBS洗滌后再用二抗常溫下孵育，DAB顯色，-actin為內參照。底片經掃描儀掃描后分析結果。

1.4.3 免疫組化方法檢測TLR4的表達

軟骨石蠟包埋組織標本制成切片，常規(guī)S-P法染色，用微波修復抗原，滴加TLR4兔抗鼠多克隆一抗（稀釋度為1：100）；滴加二抗酶標鏈霉親和素復合物，顯色，復染，封片。每次檢測均以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

免疫組化結果用BI-2000圖像分析系統(tǒng)測定各切片陽性細胞的積分吸光度值（IA），以細胞質和細胞膜染成棕黃色為陽性細胞，每一個樣本隨機選取5個高倍視野（×200），計數每平方毫米內陽性細胞數量。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用 Kruskal-Wallis秩和檢驗對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膝關節(jié)脛骨負重區(qū)軟骨、非負重區(qū)軟骨及正常股骨頭負重區(qū)軟骨中TLR4免疫組化結果

負重區(qū)軟骨TLR4表達比非負重區(qū)軟骨TLR4表達明顯升高，而對照組正常股骨頭軟骨組織中TLR4表達較實驗組明顯減少。如下圖所示（彩圖見插頁）：

圖1

圖2

圖3

圖1 A組負重區(qū)軟骨免疫組化TLR4表達（×200）；圖2 B組非負重區(qū)軟骨免疫組化TLR4表達（×200）；圖3 C組正常股骨頭軟骨免疫組化TLR4表達（×200）

2.2 膝關節(jié)脛骨負重區(qū)軟骨、非負重區(qū)軟骨及正常股骨頭負重區(qū)軟骨中TLR4及NF-B蛋白表達（免疫組化SP法，×200）

脛骨負重區(qū)軟骨 TLR4、NF-Bp65蛋白表達的較其他兩組明顯增高，根據統(tǒng)計學 Kruskal-Wallis秩和檢驗方法，＜0.05，各組間的差異具有統(tǒng)計學意義（見表1，圖4，5）。

表1 實驗負重組、非負重組與對照組TLR4、NF-Bp65蛋白表達比較（±s）

表1 實驗負重組、非負重組與對照組TLR4、NF-Bp65蛋白表達比較（±s）

注：采用Kruskal-Wallis法，＜0.05；*與對照組比較，＜0.05；**與對照組比較＜0.05；*與**比較＜0.05。

組別OA負重組OA非負重組對照組 12 n NF-Bp65 123.15±0.11* 12 TLR4 2.91±0.09* 1.93±0.07** 0.91±0.05 1.01±0.09 2.11±0.08**

圖4 TLR4的Western Blot實驗結果

圖5 NF-Bp65 Western Blot的實驗結果

2.3 Real-timePCR檢測實驗組和對照組軟骨中TLR4及NFB的mRNA表達

A組脛骨負重區(qū)軟骨TLR4、NF-Bp65的mRNA表達較其他兩組明顯增高，根據統(tǒng)計學Kruskal-Wallis秩和檢驗方法，＜0.05，各組間的差異具有統(tǒng)計學意義（見表2，圖6，7）。

表2 實驗負重組、非負重組與對照組TLR4、NF-Bp65mRNA表達比較（s）

表2 實驗負重組、非負重組與對照組TLR4、NF-Bp65mRNA表達比較（s）

注：采用Kruskal-Wallis法，＜0.05；*與對照組比較，＜0.05；**與對照組比較＜0.05；*與**比較＜0.05。

組別OA負重組OA非負重組對照組 12 n TLR4 3.55±0.05* 2.06±0.07** 1.01±0.09 1.00±0.11 NF-Bp65 122.93±0.06* 122.01±0.08**

圖6 TLR4 mRNA表達對比柱狀圖

圖7 NF-Bp65 mRNA表達圖對 比柱狀圖

3 討論

OA發(fā)表機制目前尚不明確，近年來認為OA雖然本質是軟骨破壞，但其實是一個累及關節(jié)所有組織的疾病，自身免疫在其中可能扮演重要角色[1]。Medzhitov等[3]在1997年首次在Nature雜志發(fā)文系統(tǒng)闡述了TLR4的分子生物學特性，它屬于TLR家族，和其他TLR家族成員一樣，TLR4可以特異性識別宿主機體內產生的所謂損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs），啟動自身免疫反應，NF-B是TLR4信號通路的重要下游信號分子。在類風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎關節(jié)組織破壞時，會產生大量的能被TLR4識別的DAMPs[4,5]，如軟骨基質分解產生的透明質酸片段就是TLR4的配體之一[6]，因此有理由相信關節(jié)軟骨中的TLR4可能會通過與這些配體結合后，啟動自身免疫反應從而參與OA發(fā)病。

本實驗研究了國人OA關節(jié)軟骨中TLR4和NF-Bp65的表達水平，并與正常關節(jié)軟骨對照。免疫組化、RT-PCR和WesternBlot的結果數據均顯示股骨頭負重區(qū)、實驗組脛骨非負重區(qū)及實驗組脛骨負重區(qū)軟骨中TLR4的表達依次增加，推測其原因是OA早期TLR4活化后引發(fā)一系列的炎癥反應，加重軟骨損傷。

國外有研究證實關節(jié)軟骨中TLR4的表達水平隨著關節(jié)間隙狹窄的加重而逐漸提高[7,8]，隨著 OA患者關節(jié)軟骨病變的范圍擴大，TLR4表達水平也會提高[9]。人和鼠軟骨細胞培養(yǎng)時如果TLR4被激活后會引起炎癥和軟骨細胞的分解反應，包括IL-1，MMP的表達升高，NO釋放和PGE2合成增加，聚蛋白聚糖和II型膠原合成下降[9,10]。體外實驗顯示TLR4的配體-LPS刺激會加劇軟骨移植體基質的降解[9]。相反，TLR4-/-小鼠的軟骨細胞即使被LPS激活也不會引起相同的分解反應[10]，而且TLR4-/-小鼠對IL-1過表達介導的軟骨破壞產生抵抗效應，這和 IL-1介導的內源性 TLR4配體的產生有關[11]。Haglund等[12]用蛋白質組學的方法顯示小鼠軟骨細胞 TLR4的激活會引起一系列的自身免疫反應，比如補體，長Ptx3，Chi3l1和mimecan的產生，這表明軟骨細胞在TLR4激活后可以引起自身免疫反應。

總之，TLR4的激活參與了國人OA的發(fā)病機制，具體的分子生物學機制值得進一步研究，這為將來OA的靶向藥物治療提供了新的思路。

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The preliminary research on the expression of toll-like receptor4/NF-B in human knee osteoarthritis

YuYinxian,ChenJinwei,RuanQi,etal.Departmentof Orthopaedics,ShanghaiGeneralHospital Affiliatedto JiaoTong University,Shanghai,200080,China

Objective Explore the expression of TLR4 and NF-B in human knee advanced osteoarthritis cartilage,to clarify the role of autoimmunity in osteoarthritis pathogenesis.Methods The experimental cartilages are obtained from 20 advanced knee osteoarthritis patients（The average age of 68.5years old）following total knee replacement surgery in the weight-bearingareaofthetibialarticularcartilage and thenon-weight-bearingarea.The femoralheadcartilagesof control group are obtained from 12 patients（The average age of 66.3 years old）with traumatic femoral neck fracture received total hip arthroplasty.We use immunohistochemicalmethodstoanalysisthree specimensofTLR4 expression ofcartilage, using RT-PCR and Western Blot to detect the mRNA and protein expression of TLR4 and NF-Bp65 in three groups of cartilage respectively.Results 1.Immunohistochemistry showed that the group of weight-bearing cartilage in knee osteoarthritis has thehighest expressionof TLR4,the group of non-weight-bearingcartilage in knee osteoarthritisexpress second,the groupofnormalfemoral headcartilageexpressleast.2.RT-PCRand Western Blotshow thatthegroup of weightbearingcartilage inknee osteoarthritis havethemost expressionof the mRNA and protein inTLR4andNF-B,thesecond is the group of non-weight-bearing cartilage in knee osteoarthritis,the group of normal femoral head cartilage expresses least.By using of statistical Kruskal-Wallis rank sum test methods,the difference between the groups was statistically significant.Conclusion TLR4 and NF-B express evident in osteoarthritis of the knee cartilage weight-bearing area significantly,indicating that TLR4/NF-B signal pathway overactive in OA and downstream NF-B overexpress may be involved in the pathogenesis of osteoarthritis.

Osteoarthritis;TLR4;NF-B;Cartilage;Autoimmunity

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.04.002

swgk2015-02-00028

俞銀賢（1980-）男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：關節(jié)外科。

*[通訊作者]易誠青（1974-）男，博士，主任醫(yī)師。研究方向：關節(jié)外科。

2015-02-08）

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海200080