甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

高曉東，李雪萍，李永輝，張永東，楊 凱，李海寧

1甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000；

2甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

甘肅金銀花(盤葉忍冬)抗菌作用實驗研究

高曉東1，李雪萍2△，李永輝2，張永東2，楊 凱2，李海寧2

1甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000；

2甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

目的：觀察甘肅金銀花（盤葉忍冬）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的體內(nèi)、外抗菌作用。方法：體內(nèi)抗菌用金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠，觀測給藥小鼠在染菌后7天內(nèi)的死亡率；體外抗菌用瓊脂擴散實驗和菌落計數(shù)法測定最小抑菌濃度（M IC）和抑菌圈大小。結(jié)果：對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花（盤葉忍冬）后小鼠的死亡率分別為45%和40%；正品金銀花為40%；兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。體外抗菌實驗測得甘肅金銀花（盤葉忍冬）和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 m g/m L和12.5 m g/m L。結(jié)論：甘肅金銀花（盤葉忍冬）對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有一定的體、內(nèi)外抗菌作用。

甘肅金銀花（盤葉忍冬）；體內(nèi)外抗菌；金黃色葡萄球菌；大腸埃希菌

盤葉忍冬(Lonicera tragophylla Hemsl.)屬忍冬科忍冬屬落葉藤本,具有清熱解毒、涼風散熱之功效。臨床上廣泛用于急性熱病及外科感染性疾病,如上呼吸道感染、急性扁桃體炎等［1-4］。本研究對甘肅金銀花（盤葉忍冬）在抗炎、解熱鎮(zhèn)痛方面進行研究，取得了一定成果，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物 甘肅金銀花（盤葉忍冬）水提濃縮物由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實驗中心制備，藥液濃度按生藥量計算為2.63 g/mL，實驗前用滅菌蒸餾水稀釋成所需濃度。正品金銀花購自甘肅省黃河藥市，產(chǎn)地：山東，濃縮液制備同甘肅金銀花。雙黃連口服液(哈藥集團三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：13051324)。

1.2 動物 昆明種小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22g，雌雄兼有，由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(甘)2006-0010。

1.3 菌株來源 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸埃希菌（CCTCCAB200068）均由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)生物中心提供。

1.4 試劑與儀器 BUCHI461旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士)；JA-2003電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ClassⅡ，TypeA2型生物安全柜(力康集團全資附屬公司新儀器上海有限公司)；立式壓力蒸氣滅菌器(LS-B50)；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密儀器廠)。

1.5 方法與步驟

1.5.1 體內(nèi)抗菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用。選取健康小鼠140只，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄各半，隨機分為7組，即空白對照組、模型對照組、雙黃連組、正品金銀花組，甘肅金銀花(盤葉忍冬)高劑量組(28.8g/kg)、中劑量組(14.4g/kg)、低劑量組(7.2 g/kg)。各組動物按劑量連續(xù)灌胃給藥3天(空白對照組和模型對照組給予等容量蒸餾水，金銀花對照組在感染菌前1天開始給藥)，1次/d。感染前小鼠禁食過夜，第3天給藥后30分鐘，根據(jù)菌株毒力的預(yù)實驗情況選用使80%～100%小鼠死亡的金黃色葡萄球菌的干酵母懸液8.6×105cfu/mL (或大腸埃希菌6.1×106cfu/mL)，0.5 mL/只，給小鼠腹腔注射造成感染(空白對照組注射等容量干酵母生理鹽水溶液)。感染后6小時再給藥1次，繼續(xù)給藥1天，觀察和記錄各組動物感染后7天內(nèi)的反應(yīng)情況以及死亡數(shù)［5-6］。

1.5.2 體外抑菌實驗 將上述中藥各稱取20 g，加入約5倍量水，浸泡過夜后，文火煮沸30分鐘，過濾后，再加5倍量水，文火煮沸30分鐘，過濾。將2次濾液合并后在文火上濃縮至20 mL，即為100%中藥原液。調(diào)pH值為7.6。

1.5.3 菌落計數(shù)法［7-8］將中藥原液105℃，20分鐘滅菌后即為實驗藥液。用接種環(huán)將金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時，傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)18小時，再傳種于無菌肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時，用前將菌液濃度1∶1000稀釋。取無菌試管270支，分3組，每管加肉湯培養(yǎng)基1 mL，第1管加所試藥液混勻后，使1～9管均含有倍比稀釋的藥液(即1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024)。第1、2、3、4、5、6、7、8、9管每管加菌液0.05 mL，充分混勻后，37℃培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。藥液對照管以第9管無細菌生長，菌液對照管第10管有細菌生長，實驗方為有效。以能抑制試驗菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度MIC。

1.5.4 瓊脂擴散法［9］每平皿加0.1mL菌液(菌液濃度為1.0×105cfu/mL)，涂布整個培養(yǎng)基表面，37℃吸附30分鐘，然后上面均勻放置4個直徑約為6 mm的無菌不銹鋼牛津杯。然后用移液器在孔中加藥液200 μL；37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時后觀察并記錄抑菌圈的有無及其直徑大小(重復(fù)2次，每次做4孔，求直徑的平均值)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)抗菌實驗 對感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌小鼠灌胃甘肅金銀花(盤葉忍冬)后小鼠的死亡率分別為45%和40%；正品金銀花為40%；兩者與模型對照組小鼠死亡率的95%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 甘肅金銀花(盤也忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌感染小鼠的保護作用(n=20)

2.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)和正品金銀花對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度為6.25 mg/mL和12.5 mg/mL。對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小分別為15 mm和19 mm；對大腸埃希菌的抑菌圈大小為16 mm和19 mm，見表2—3。

表2 最小抑菌濃度測定結(jié)果 m g/m L

表3 甘肅金銀花(盤葉忍冬)瓊脂擴散法抑菌實驗結(jié)果(n=8)

3 討論

3.1 體內(nèi)抗菌實驗 與空白對照組比較，模型對照組的小鼠死亡率為95.0%(P＜0.01)，表明濃度為8.6×105cfu/mL的金黃色葡萄球菌(或濃度為6.1×106cfu/mL大腸埃希菌)的干酵母懸液能引起小鼠死亡，造模成功。與模型對照組比較，雙黃連口服液組與正品金銀花組死亡率明顯降低(P＜0.05)；甘肅金銀花(盤葉忍冬)高、中、低各劑量組死亡率明顯降低(P＜0.05)。提示甘肅金銀花(盤葉忍冬)具有對金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌致小鼠感染死亡的保護作用，顯示了一定的體內(nèi)抗菌作用。體內(nèi)抗菌實驗主要研究藥物對感染動物的預(yù)防和保護作用，因此體內(nèi)抗菌實驗是最重要的抗菌作用的研究方法，對于研究中藥的抗微生物作用有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的急性死亡期主要集中在48小時之內(nèi)，之后存活小鼠可逐漸恢復(fù)健康。此外，通過死亡小鼠尸體解剖發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌能明顯引起小鼠小腸炎性壞死，大腸埃希菌可致小鼠肺部感染壞死。

3.2 體外抑菌實驗 甘肅金銀花(盤葉忍冬)對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有抑制作用，對兩種菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為6.25mg/mL和12.5 mg/mL，與正品金銀花基本一致。較雙黃連口服液對兩種菌的抗菌作用弱，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與空白對照(蒸餾水)比較，其抗菌作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

［1］ 申丹，唐仕歡，盧朋，等.《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準——中藥成方制劑》金銀花用藥規(guī)律分析［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(3):10-13.

［2］ 賀偉.金銀花的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，4(24):8-9.

［3］ 管仲瑩，趙金明，林巧智.金銀花提取物抑菌作用的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(15):150-151.

［4］ 王天志，李永梅.金銀花的研究進展［J］.華西藥學(xué)雜志，2000，15(4)：292-294.

［5］ 徐淑云，卞如滾，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：1657-1666.

［6］ 常翠，董淳，楊宏圖，等.清喉口含片動物體內(nèi)、外抑菌實驗研究［J］.中國藥房，2006，17(5)：336-338.

［7］ 袁永成.山楂粗黃酮抗氧化能力及抑菌活性研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2012(2)：53-56.

［8］ 蘇香萍，龔大春，張亞雄，等.金銀花二氧化碳超臨界萃取物的體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(4)：832-834.

［9］ 潘清平，雷志君，周日寶，等.灰氈毛忍冬與正品金銀花抑菌作用的比較研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(2)：243-244.

Experimental Study on Antibacterial Effects of Gansu Honeysuckle

GAO Xiaodong1,LI Xueping2△,LI Yonghui2,ZHANG Yongdong2,YANG Kai2,LI Haining2
1 TCM Department of Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention，
Lanzhou 730000,China；
2 Medical Transformation Research Center of Gansu Provincial Medical and Scientific Academy

Objective:To observe antibacterial effects of Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.)on Staphylococcus aureus(SA)and E.coli in vivo and vitro.Methods:Mortality rate of the medicated mice were detected in seven days after the mice were infected by SA and E.coli;minimal inhibitory concentration(MIC)and the size of inhibition zone were measured through agar diffusion experiments and bacterial colony counting method.Results: SA-infected and E.coli-infected mice were treated by Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle,mortality rates of SA-infected and E.coli-infected mice treated by Gansu honeysuckle were 45%and 40%respectively;mortality rate of genuine honeysuckle was 40%;the difference was significant when both were compared with model control group with the mortality rate 95%(P＜0.05).The results of antibacterial test showed that MIC of Gansu honeysuckle and genuine honeysuckle against SA and E.coli were 6.25 and 12.5 mg/mL.Conclusion:Gansu honeysuckle shows antibacterial effects to SA and E.coli in vivo and vitro to a certain degree.

Gansu honeysuckle(Lonicera tragophylla Hemsl.);antibacterial effects in vivo and vitro;SA;E.coli

R284.1

A

1004-6852(2015)11-0017-03

2014-12-15

高曉東(1964—)，男，副主任醫(yī)師。研究方向：中藥藥理。

△通訊作者：李雪萍(1964—)，女，副主任檢驗師。研究方向：中藥藥理。