Peroxiredoxin 2基因RNAi慢病毒載體構建及對SW480細胞增殖的影響*

馮繼紅，傅仲學△，文坤明，盧偉東，王 昊，陳旺盛，郭金寶，張壽儒

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科 400016；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563003；3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川瀘州 646000)

論著·基礎研究

Peroxiredoxin 2基因RNAi慢病毒載體構建及對SW480細胞增殖的影響*

馮繼紅1，傅仲學1△，文坤明2，盧偉東1，王 昊1，陳旺盛3，郭金寶1，張壽儒1

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科 400016；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563003；3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，四川瀘州 646000)

目的 構建Peroxiredoxin2(PRDX2)基因RNA干擾(RNAinterference,RNAi)慢病毒表達載體，探討PRDX2基因干擾后對結直腸癌SW480細胞增殖的影響。方法 設計、合成靶向PRDX2的RNA干擾的序列，構建pGC-EGFP-shPRDX2慢病毒載體并進行鑒定，同時應用qRT-PCR和Westernblot方法觀察轉(zhuǎn)染的SW480結腸癌細胞PRDX2mRNA和蛋白表達的抑制效果，并通過MTT、平板克隆形成實驗檢測細胞增殖變化。結果 成功構建PRDX2基因慢病毒載體并經(jīng)測序證實；pGC-EGFP-shPRDX2可有效抑制結直腸癌SW480細胞PRDX2的表達，感染慢病毒的SW480細胞中PRDX2mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；SW480細胞經(jīng)PRDX2RNA干擾后其生長和增殖能力顯著降低(P<0.05)。結論 PRDX2基因RNAi慢病毒表達載體在SW480細胞中表達穩(wěn)定可靠，PRDX2基因干擾后有效抑制了結直腸癌SW480細胞的增殖和生長，為進一步探討PRDX2在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎。

結直腸腫瘤；基因表達；綠色熒光蛋白質(zhì)類；過氧化還原蛋白2；慢病毒載體

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一。全球范圍內(nèi)，結直腸癌分別位居男、女性惡性腫瘤的第3、4位，導致每年61萬人死亡[1-2]。在中國，近年結直腸癌發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡明顯提前，每年約有 40 萬新發(fā)病例，現(xiàn)在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第2位[3]。

隨著腫瘤的快速生長，腫瘤組織內(nèi)常常會出現(xiàn)局限性缺氧灶，并且這些缺氧灶隨著腫瘤內(nèi)血管的生長而變化。低氧導致了活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，細胞保護系統(tǒng)可破壞ROS并修復其造成的損害。過氧化還原蛋白2(peroxircdoxin 2,PRDX2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量在20～30×103的過氧化物酶家族(peroxircdoxins，PRDXs)成員之一，可通過其過氧化物酶等功能或以分子伴隨物形式在腫瘤細胞對抗ROS、放化療抵抗、細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤血管形成等過程中發(fā)揮重要作用。前期實驗結果證實PRDX2基因在結直腸癌中表達上調(diào)，且與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系[4]。本實驗通過構建PRDX2基因的慢病毒表達載體，制備高滴度慢病毒顆粒并感染結直腸癌SW480細胞株，檢測PRDX2在mRNA 和蛋白質(zhì)水平的表達情況，同時觀察感染慢病毒的SW480細胞株其生長和增殖情況，為進一步探討PRDX2基因?qū)Y直腸癌SW480細胞生物學行為的影響及其分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 人結直腸癌SW480細胞株購自中國生命科學院上海細胞庫，HpaI和XhoI酶切、增強劑Eni.S、polybrene購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，QIAGEN Plasmid大抽Kit購自QIAGEN，T4 DNA ligase購自NEB公司，Taq DNA polymerase、dNTP Mix、DNA Ladder 購自Fermentas 公司，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase購自Takara公司，胎牛血清(FBS)、牛血清清蛋白(BSA)購自上海微科生化試劑有限公司，DMEM、Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基購自GIBCO公司，蛋白裂解液 RIPA 和蛋白酶抑制劑 PMSF 均購自于上海生物試劑廠，胰酶購自上?；瘜W試劑公司，BCA蛋白含量試劑盒購于南京凱基生物公司，PRDX2一抗購自美國Abcam公司，GAPDH、GFP 抗體和HRP標記鼠二抗均購于Santa Cruz 公司。

1.1.2 RNAi重組慢病毒載體 據(jù)GeneBankPRDX2基因轉(zhuǎn)錄本(NM_005809.4)設計5個針對PRDX2基因的siRNA序列和陰性對照(negative control)siRNA，構建的目的慢病毒載體命名為pGC-EGFP-shPRDX2，由上海吉凱基因化學技術有限公司構建和包裝。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增及產(chǎn)物鑒定 針對目的基因序列，據(jù)RNA 干擾序列設計原則，設計多個 RNA 干擾靶點序列，選擇最佳的動力學參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗流程；同時設計RNAi 陰性對照Scramble 序列(5′-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3′)。針對靶點設計5條shRNA，分別命名為：PRDX2-RNAi(8818-2)、PRDX2-RNAi(8819-1)、PRDX2-RNAi(8820-1)、PRDX2-RNAi(8821-1)、PRDX2-RNAi(8822-1)，見表1。PCR 反應條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 6 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行純化回收后，經(jīng)雙酶切后的pGC-EGFP 載體連接產(chǎn)生shRNA慢病毒載體；對酶切片段進行回收、連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單菌落鑒定，引物是：上游5′- TTC TAC CCT CTG GAC TTC ACT-3′；下游 5′- GCA ATG CCC TCA TCT GTT- 3′，產(chǎn)物大小：251 bp。反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。設立陰性對照組(空載質(zhì)粒為模板)和陽性對照組(插入GAPDH片段的載體組)，對假陽性和假陰性結果進行排除。對PCR 陽性克隆片段測序，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中將測序出的結果進行Blast比對。

1.2.2 慢病毒的包裝與病毒滴度測定 293 T細胞用含100 mL/L FBS的 DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。5個重組慢病毒質(zhì)粒和空慢病毒載體分別與輔助包裝載體質(zhì)粒，用LipofectamineTM2000 共轉(zhuǎn)染293T 細胞，具體方法參考試劑說明書進行操作。48 h后在熒光顯微鏡下觀察到細胞綠色熒光的產(chǎn)生，收集上清液，20 000 r/min 超速離心3 h并濃縮病毒。最后包裝產(chǎn)生的慢病毒有兩種，即含有PRDX2基因序列的慢病毒pGC-EGFP-shPRDX2和空載對照慢病毒 pGC-EGFP-NC。逐孔稀釋滴度測定法和PCR 測定其病毒滴度(TU/mL)。獲得PRDX2 siRNA慢病毒溶液(5個干擾序列慢病毒液分別以設計的PRDX2干擾序列編碼命名)及空載對照慢病毒pGC-EGFP-NC，病毒液分裝后于-70 ℃保存。

1.2.3 病毒感染SW480細胞并檢測其干擾效果 將SW480細胞計數(shù)并均勻平鋪于6孔板，使其感染時細胞匯合率達60%左右，按照種植的SW480細胞數(shù)及MIO值(MIO=50)計算所加的病毒量，病毒原液用增強劑Eni.S稀釋，使其濃度為標準濃度(1×108)，依次加入終濃度為8 μg/mL Polybrene、Eni.S、L-15培養(yǎng)基及計算的標準濃度病毒液，總體積為1 mL。將含有PRDX2基因片段的慢病毒pGC-EGFP-shPRDX2與pGC-EGFP-NC分別感染SW480細胞。感染后的SW480細胞根據(jù)感染的病毒命名分組為pGC-EGFP-shPRDX組、pGC-EGFP-NC組，同時將未感染的SW480細胞作為空白對照組。各組細胞常規(guī)培養(yǎng) 24 h后更換為含有3 μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)的L-15培養(yǎng)液進行抗性篩選，感染至3 d后行熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，在藥物選擇壓力下培養(yǎng)4 d后收獲細胞進行檢測。

1.2.4 Western blot 法檢測 將pGC-EGFP-shPRDX2和pGC-EGFP-NC成功轉(zhuǎn)染至SW480細胞，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率達95%以上。細胞分組如下：將GAPDH作為陽性對照組、空載對照慢病毒(pGC-EGFP-NC)以及由5個針對PRDX基因的序列的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒細胞組。收集各組細胞，PBS洗滌2次，離心棄上清液，加入100 μL預冷的RIPA細胞裂解液，置冰上30 min，4 ℃、12 000 g 離心15 min，取上清液并進行蛋白定量(BCA)法。取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，經(jīng)100 ℃、10 min 變性后用100 g/L的十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。蛋白半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，加入小鼠抗人PRDX2的一抗或小鼠抗人GADPH的一抗，4 ℃過夜，TBST溶液再次洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，化學發(fā)光(eleetroehemiluminescence,ECL)觀察，將膠片拍照后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，實驗重復3次。

表1 化學合成的目的基因PRDX2的5條干擾序列

1.2.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 采用qRT-PCR技術檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后的SW480細胞中PRDX2 mRNA水平表達。Trizol 抽提細胞RNA，采用Oligo(dT)引物和隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄，以各組細胞cDNA作為模板，每個組設立3個復孔進行qRT-PCR檢測。GAPDH上游引物為：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游引物為：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA -3′，引物序列長度225 bp；PRDX2基因上、下游引物為5′- CGG ACT ACA AAG GGA AGT ACG TG-3′、下游引物為5′- CCA GGT GGG TGA ACT GAG AGT C -3′，引物序列長度162 bp。PCR 的反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s(40 個循環(huán))，反應完成后，得出Ct值，2-ΔΔCT法計算出相對表達量，分析各組之間PRDX2基因的mRNA相對表達的差異。

1.2.6 四唑鹽(MTT)法測定細胞相對抑制率 取狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期各組細胞，0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整濃度為1×104個/mL，均勻接種于96孔板內(nèi)，每孔加200 μL L-15培養(yǎng)基；陰性對照組與空白對照組，每組設6個復孔，常規(guī)培養(yǎng)，每2天換1次液，連測7 d；每天固定時間向每孔加新鮮配制的5 g/L的MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h；輕洗去上清液后每孔加DMSO 150 μL，水平震蕩混勻，酶標儀于490 nm波長處測吸光度(A)值，取6孔平均值，繪制生長曲線。

1.2.7 平板克隆形成實驗 取pGC-EGFP-NC組及pGC-EGFP-shPRDX2組的SW480細胞消化后平鋪于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，待細胞生長出肉眼觀察可見有明顯克隆群落時取出結晶紫染色，拍照并計算細胞克隆生長群落。

2 結 果

2.1 慢病毒表達載體pGC-EGFP-shPRDX2的構建與酶切鑒定 以PRDX2基因全長克隆為模板，擴增出PRDX2基因編碼框的序列，用PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，PRDX2基因產(chǎn)物純化后與載體pGC-EGFP行酶切、連接、轉(zhuǎn)化，并得到數(shù)十個克隆，挑取5個克隆，搖菌后進行菌液鑒定，結果表明可擴增出約340 bp的目的片段(圖1)。經(jīng)測序鑒定與GenBank NM_005809.4序列一致，重組載體pGC-EGFP-shPRDX2構建成功。

1：ddH2O；2：pGC-EGFP；3：marker；4～8：pGC-1,2,3,4,5。

圖1 陽性克隆 PCR 鑒定

2.2 慢病毒的包裝與病毒滴度的測定 慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，于轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察其293T細胞發(fā)出的綠色熒光(圖2)。經(jīng)測定，慢病毒pGC-EGFP-shPRDX2濃縮后的病毒滴度大約為2×109TU/mL，pGC-EGFP-NC濃縮后的病毒滴度則為2×108TU/mL。

A:pGC-EGFP-shPRDX2;B:pGC-EGFP-NC。

圖2 293 T 細胞病毒感染后熒光顯微鏡觀察(×200)

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染SW480細胞后熒光表達檢測 SW480細胞感染pGC-EGFP-shPRDX2 72 h后在熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光表達，從明視野和熒光視野二者比較中，可見其感染效率較高，可達95%以上，見圖3。

A：明視野；B：熒光視野。

圖3 轉(zhuǎn)染SW480細胞72 h熒光表達檢測(×200)

1：陽性對照組；2：空白細胞組；3：pGC-EGFP-NC組；4～8：含有針對PRDX2基因的不同干擾序列的RNAi慢病毒載體質(zhì)粒細胞組(5、7表示有明顯敲減效果)。

圖4 Western blot 法檢測感染后SW480細胞中PRDX2的蛋白水平

*：P<0.05，與pGC-EGFP-NC組比較。

圖5PRDX2基因沉默在SW480細胞中的PRDX2 mRNA表達

*:P<0.05，與空白對照組及pGC-EGFP-NC組比較。

圖6 MTT檢測PRDX2 RNAi對SW480細胞增殖抑制作用

2.4 Western blot 和qRT-PCR檢測分析 檢測轉(zhuǎn)染不同序列 pGC-EGFP-shPRDX2慢病毒的SW480細胞中PRDX2蛋白表達水平，與pGC-EGFP-NC組相比，RNAi慢病毒載體質(zhì)粒細胞組中5和7泳道表示對SW480細胞中PRDX2表達有明顯敲減作用，其中7泳道PRDX2-RNAi(8822-1)的敲減效果最強，達到幾乎完全抑制效果(圖4)。qRT-PCR檢測PRDX2基因的mRNA相對表達水平，與pGC-EGFP-NC組比較，pGC-EGFP-shPRDX2組的PRDX2基因表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可說明在mRNA水平基因敲減有效，見圖5。

2.5 MTT法檢測 MTT法檢測各組SW480細胞6 dOD值，繪制生長曲線，結果顯示，與pGC-EGFP-NC組及空白對照組相比，SW480 pGC-EGFP-shPRDX2組細胞增殖能力受到顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

2.6 平板克隆形成實驗 細胞平板克隆形成實驗結果(圖7)顯示，與pGC-EGFP-NC組及空白對照組比較，pGC-EGFP-shPRDX2組的平板克隆形成能力明顯降低(P<0.05)。

*：P<0.05，與空白對照組及pGC-EGFP-NC組比較。

圖7 pGC-EGFP-shPRDX2對SW480細胞平板克隆形成能力的影響

3 討 論

生命有機體在不斷進化和演變過程中，逐漸形成能夠有效清除ROS產(chǎn)生的自由基等有害物質(zhì)的細胞保護性防御系統(tǒng)，過氧化物酶類、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及谷胱甘肽共同組成了細胞防御系統(tǒng)。PRDXs家族在細胞內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化保護性功能，通過過氧化物酶活性，可減少或清除過氧化氫、過氧亞硝酸鹽和一系列有機氫過氧化物(ROOH)，該家族包括6個成員，廣泛存在于真核及原核生物中。PRDX2屬于PRDXs家族2-Cys PRDXs(PRDX 1～5)成員，是機體氧化代謝的重要酶之一，主要分布于細胞質(zhì)[5]。PRDX2最主要的生物學功能是抗氧化，同時可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)H2O2濃度，參與H2O2介導的信號轉(zhuǎn)導途徑[6]。PRDX2以硫氧還蛋白為電子供體，清除活性氧族，與生物的生長發(fā)育、細胞衰老、免疫抑制密切相關，并在維持紅細胞生存，促進NK細胞發(fā)揮自然殺傷功能的過程中扮演重要角色[7-8]。

近年來，隨著研究的不斷深入，PRDX2與腫瘤的關聯(lián)機制逐漸被揭示，PRDX2不僅通過發(fā)揮抗氧化、分子伴侶、信號調(diào)節(jié)等功能維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，還通過多種信號轉(zhuǎn)導途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、血管生成以及放化療抵抗[9-13]。有研究報道，PRDX2可抑制DNA損傷誘導的腫瘤細胞死亡，更重要的是，這種保護性作用僅限于在腫瘤細胞內(nèi)，且并非是通過過氧化物酶活性發(fā)揮作用的[14]。既往研究表明，在乳腺癌、肝癌、骨肉瘤及前列腺癌中PRDX2高表達，被認為是促癌因子，但在急性粒性白血病[15]、膀胱癌、黑色素瘤中表達降低，又被認為是抑癌因子。那么PRDX2在腫瘤細胞中究竟發(fā)揮什么角色？是發(fā)揮抗癌作用還是抑癌作用？這些爭議仍有待探索。至今，PRDX2在結直腸癌中的作用尚未有明確報道，本研究前期實驗研究也初步證實PRDX2在結直腸癌組織及細胞株中表達上調(diào)，且與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后有關。根據(jù)本實驗結果，觀察到轉(zhuǎn)染pGC-EGFP-shPRDX2建立的穩(wěn)定SW480細胞株其形態(tài)學發(fā)生了變化，不僅增殖和生長能力減弱，抗菌及抗凋亡能力也明顯降低，但同時也發(fā)現(xiàn)細胞黏附能力和轉(zhuǎn)移能力反而增強，這些生物學功能的變化雖仍需進一步驗證，但亦可為下一步的研究提供一種思路，PRDX2在結直腸癌中是否可能發(fā)揮更為關鍵的作用，是否存在雙向調(diào)控作用尚需證實，其具體分子調(diào)控機制也有待深入探討。

本實驗設計的針對PRDX2的特異性RNA干擾序列，將干擾序列定向克隆轉(zhuǎn)接并感染目的細胞。為了驗證PRDX2基因的siRNA重組體構建成功，本研究采用PCR鑒定和DNA測序鑒定構建的PRDX2基因siRNA慢病毒載體，證實了插入片段的序列正確，重組體構建成功。將5種構建的干擾重組體轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒，通過直接感染目的細胞，可有效避免感染目的細胞株出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象。實驗得到的PRDX2 RNAi SW480細胞株，通過初步的功能學實驗，證實了PRDX2基因敲減后可有效抑制結直腸癌SW480細胞的增殖和生長，這些初步研究結果為探討PRDX2基因敲減后SW480細胞的成瘤特性、細胞周期變化及對抗腫瘤藥物的敏感性等方面提供研究支撐，同時也為探討PRDX2基因在結直腸癌中的具體調(diào)控作用及分子作用機制奠定研究基礎。

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Construction of lentiviral vector of peroxiredoxin 2 gene mediating RNAi and its effects on the proliferation of SW480 cell*

FengJihong1,FuZhongxue1△,WenKunming2,LuWeidong1,WangHao1,ChenWangsheng3,GuoJinbao1,ZhangShouru1

(1.DepartmentofGastroenterologicalSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.DepartmentofgastroenterologicalSurgery,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;3.DepartmentofGastroenterologicalSurgery,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Scihuan646000,China)

Objective To construct a lentiviral expression vector ofperoxiredoxin2(PRDX2) RNA interference (RNAi) and to investigate the effect of siRNA ofPRDX2 genes on the proliferation of human colonrectal cancer SW480 cell.Methods RNAi target sequences were designed and synthesized towards thePRDX2 gene sequences.The lentiviral vector pGC-EGFP-shPRDX2 was constructed and identified.The vector was transformed into SW480 cells,and the transfection efficiency was evaluated by fluorescence microscopy.The expression of PRDX2 was detected with Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blot in the transfected cells.Cell growth and colony forming ability were detected with MTT and plate cloning technique.ResultsPRDX2 gene lentiviral vector was successfully established and was proved by gene sequencing.The expression of PRDX2 in mRNA and protein was significantly reduced(P<0.05).The PRDX2 mRNA and protein expression in SW480 transfected with lentiviral were significantly reduced (P<0.05),and the ability of growth and proliferation were significantly reduced(P<0.05).ConclusionPRDX2 gene lentiviral vector could be a stable and reliable tool.The proliferation and growth of SW480 cells transfected by pGC-EGFP-shPRDX2 could be effectively suppressed,which could facilitate further investigation of the roles ofPRDX2 gene in the development and progression of colorectal cancer.

colorectal neoplasms;gene expression;green fluorescent proteins;peroxiredoxin 2(PRDX2);lentivirus vector

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.01.005

國家自然科學基金資助項目(81172295)。 作者簡介：馮繼紅(1977-)，副教授，博士，主要從事腫瘤干細胞和腫瘤免疫研究,現(xiàn)單位變更為遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院。△

,Tel:(023)67706399;E-mail：fzx990521@sina.com。

R

A

1671-8348(2015)01-0014-04

2014-09-12

2014-10-14)