凋亡基因Survivin，P53，Bcl-2和Bax在喉癌組織中的表達及與放療的敏感性

李雷激，劉躍華，高琳，趙沖

凋亡基因Survivin，P53，Bcl-2和Bax在喉癌組織中的表達及與放療的敏感性

李雷激，劉躍華，高琳，趙沖

（四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川瀘州646000）

目的：檢測放療前后Survivin、P53、Bcl-2和Bax在喉黏膜上皮組織中的表達，探討其表達及與喉癌放療敏感性的關系。方法：采用免疫組化SP法檢測Survivin、P53、Bcl-2和Bax在56例單純放療的喉癌患者石蠟標本中的表達，同時用聲帶息肉正常喉黏膜組織石蠟塊各10例進行對照，對所有患者進行1～5年的隨訪，同時檢測放療1年、3年、5年后上述四種癌基因蛋白表達情況與初次檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：Survivin、P53和Bcl-2在聲帶息肉組織中低表達，而Bax則呈相對高表達；Survivin、P53、Bcl-2在喉癌組織中呈高表達，而Bax則呈相對低表達。56例單純放療的喉癌患者中，放療前及放療1年、3年、5年后Survivin檢出率分別是82.1%、67.1%、53.9%、32.8%。分析具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。P53放療前的表達率76.7%，放療1年、3年、5年后分別是54.6%、40.1%、26.8%，分析有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bcl-2放療前為80.1%，放療1年、3年、5年后分別為65.3%、42.1%、30.9%。分析有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bax放療前52.4%，放療1年、3年、5年后分別是49.3%、50.4%、47.7%，分析無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：Survivin、P53和Bcl-2在喉癌組組織中具有高表達，對放療敏感的喉癌患者放療后凋亡抑制基因Survivin、P53和Bcl-2呈現(xiàn)表達率降低的趨勢，而Bax呈現(xiàn)表達率升高的趨勢，將Survivin、P53、Bcl-2和Bax基因作為判斷喉癌患者放療敏感性的分子指標具有一定的臨床運用價值。

喉鱗癌；放療；基因

喉癌作為頭頸部常見的惡性腫瘤，其治療一直以來以手術為主的綜合治療。放療往往廣泛應用于術后補充輔助治療，或因患者年老體弱、腫瘤侵犯范圍過廣而作姑息治療使用，但于放療而言其優(yōu)勢在于能最大程度保留患者喉支架的完整性，從而提高患者發(fā)音、進食等方面的生活質(zhì)量。但由于個體差異大，單純放療的療效尚具有不確定性，故如何選擇適合的生物學指標來對放療的敏感性進行預判受到研究人員的重視。隨著對凋亡增殖基因，抑制的研究的深入，目前認為Survivin、P53、Bcl-2在喉癌組織中具有高表達本以得到廣泛認可，而Bcl-2、Bax之間平衡關系的失調(diào)誘發(fā)腫瘤的觀點也為研究所接受。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析我院1993年至2010年期間符合納入標準的住院單純放療喉癌患者病歷資料56例，年齡42～83歲，其中男55例，女1例，所有病理均經(jīng)病理活檢證實，其中高分化鱗癌38例，中-低分化18例。聲門上型8例、聲門型40例、聲門下型8例。T1期7例、T2期42例、T3期4例、T4期3例。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。治療方法采用單純CO60照射原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶，劑量60～70 GY，每天2 GY，連續(xù)5 d后休息2 d，全部病例均予以隨訪，隨訪主要通過門診復查，電話及信件隨訪；隨訪石蠟標本的取得：以放療后1年、3年、5年仍健在且來院復查有原部位再次活檢史，并經(jīng)病理活檢證實未復發(fā)的病例。另外選擇同時期四川醫(yī)科大學病理科聲帶息肉、正常喉黏膜組織石蠟塊各10例進行對照。

1.2 主要試劑及來源

即用型人單克隆抗體及檢測試劑購自于武漢博士德公司。

1.3 方法

石蠟標本常規(guī)切片，厚度4μM。采用免疫組織化學SP法，以微波行抗原熱修復，Survivin、P53使用pH 6.0枸櫞酸緩沖液，微波熱修復10 min，Bcl-2使用pH 9.0 EDTA修復液，微波熱修復15 min，所使用抗體濃度分別為1∶80（Survivin），1∶50（P53）。用已知Bax表達陽性的肝癌組織切片為對照片，已知Bcl-2表達陽性的胃癌組織切片為對照片，Survivin選用乳腺癌組織做陽性對照。P53選用肺癌組織做陽性對照。用磷酸鹽緩沖液代替抗體做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

采用德國萊卡病理圖像采集系統(tǒng)進行圖像采集，Survivin、P53、Bcl-2、Bax的陽性反應定位以胞質(zhì)或胞膜著色呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)值以x±s表示，使用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 放療療效判定

根據(jù)喉癌患者放療后生存時間（1、3、5年）來判定療效對喉癌的敏感性。

2 結(jié)果

免疫組化染色顯示，Bcl-2及Bax蛋白表達主要位于細胞漿，呈棕黃色顆粒，Bc1-2蛋白部分表達于細胞核。在高分化的喉癌中，陽性細胞分布在癌巢周圍，同時中心細胞及周圍細胞染色陰性。在低分化的喉癌中，陽性細胞增加并且分布在整個癌巢（見圖1、2）。

隨著生存年限的提高(即喉癌放療敏感性的增強)，Bcl-2基因表達逐漸減弱，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0．05；而Bax基因表達逐漸增強，差異有統(tǒng)計學意義P＜0．05；喉癌組織Bc1-2和Bax基因表達呈顯著負相關關系(P＜0．01，見圖3）。

圖1 Bcl-2染色陽性細胞呈棕黃色表達于高分化鱗癌細胞胞漿中

圖2 BAX染色陽性細胞呈棕黃色表達于高分化鱗癌細胞胞漿中

圖3 喉癌放療敏感性與四種基因表達的關系

3 討論

細胞凋亡又稱程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是由基因編碼調(diào)控的細胞主動自殺過程，細胞凋亡過程受多基因的精確調(diào)控而實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)凋亡通路上的缺陷會導致各種疾病從神經(jīng)變性到惡性腫瘤。闡明細胞凋亡途徑的核心機制有利于提供新的治療腫瘤的方法。治療腫瘤的目的在于使腫瘤細胞死亡。臨床采用的化療、放療和一些生物療法治療腫瘤，其作用機制之一就是誘導腫瘤細胞凋亡，達到殺死腫瘤細胞的目的。治療的一個新方法是通過基因和藥理學方法修復凋亡蛋白，近來誘導細胞中的凋亡或PCD被認為是成功治療的基礎。Bcl-2首先被從濾泡狀非霍奇金淋巴瘤患者的14和18號染色體t(14∶18)易位斷裂點克隆。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白質(zhì)，不僅存在于B細胞淋巴瘤中，而且在鱗狀上皮基底層、神經(jīng)組織、唾液腺導管上皮及前列腺等組織中均能檢測到。Bax和Bcl-2形成異源二聚體，和它自己形成同源二聚體，當Bax在細胞中過度表達時，凋亡對死亡信號反應加強，激活死亡，當Bcl-2過度表達，Bcl-2和Bax形成二聚體，凋亡受到抑制.Bcl-2/Bax的比例作為一個變阻器決定對凋亡的敏感性。Survivin表達不僅與腫瘤的發(fā)生有關，而且與腫瘤的進展及預后密切相關。研究發(fā)現(xiàn)Survivin的表達水平與肺癌的病理演進有關：在從伴輕度不典型增生到伴高度不典型增生或癌的轉(zhuǎn)變過程中，其表達顯著增加。

喉癌的治療一直以來是以手術為主的綜合治療，但隨著社會的發(fā)展，越來越重視患者術后的發(fā)音、進食等生存質(zhì)量方面的問題，對喉癌患者喉功能的保全成為在最大程度根除腫瘤基礎上首先要考慮的問題，放療能最大程度保留喉支架的完整性，從而保全喉的功能，然而喉癌放射治療最大的弊端就是敏感性個體差異很大，單純放療尚不被廣泛接受。近年來隨著分子生物學理論及其技術在醫(yī)療研究中的不斷應用，證實放射線能夠引起細胞凋亡，放療中的理想情況是射線引起腫瘤細胞的死亡，而正常細胞不受影響。研究表明：放射線引起的細胞凋亡可能依賴于P53基因蛋白的介導,受Bcl-2基因蛋白水平調(diào)控，因此，P53基因及Bcl-2基因表達有可能作為判定腫瘤放射治療療效的參考指標[1]。也有學者認為：放射治療后能產(chǎn)生速發(fā)型凋亡的組織，其輻射敏感性相對較高，許多研究證實，電離輻射可調(diào)控Bcl-2家族基因表達，其表達依賴于野生型P53的Bcl-2的表達下調(diào)及Bax的表達上調(diào)[2～4]。Bcl-2表達增強拮抗輻射誘導的細胞凋亡，而Bax、Bcl-2高表達則增強腫瘤輻射敏感性。Bcl-2家族抗凋亡成員如Bcl-2與Bcl-X及促凋亡成員Bax、Survivin、P53等促、抗凋亡蛋白數(shù)量變化可調(diào)節(jié)細胞對凋亡刺激的反應，在一定程度上也反映了腫瘤的輻射敏感性[5]。Survivin、P53及Bcl-2基因表達在喉癌組織中從無表達到強表達不等，將Survivin、P53及Bcl-2基因表達強度分為強度表達、中度表達及陰性表達，并探討了每種基因表達與喉鱗癌放療敏感性的關系。發(fā)現(xiàn)放療敏感組Survivin、Bcl-2基因表達較低，而放療非敏感組Bcl-2基因表達較高，放療敏感性與Bcl-2基因表達相關。而P53基因表達則相反，放療敏感組Survivin、P53基因表達較高，放療非敏感組P53基因表達較低。結(jié)果表明放療敏感性與Survivin、Bcl-2及P53基因表達具有相關性，全相關系數(shù)較低[6-8]。因此顯示Survivin、P53和Bcl-2基因綜合表達強度與喉癌放療敏感性具有更高的相關性。當然，喉癌放療敏感性是受多種因素影響決定的，如能應用這些因素對喉癌放療敏感性進行綜合判定，是預測喉癌患者放射治療敏感性及預后的較好的指標。

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（2015-03-20收稿）

我校獲教育部第八屆高校校園文化建設優(yōu)秀成果獎

近日，教育部下發(fā)通知，公布了第八屆高校校園文化建設優(yōu)秀成果評選獲獎名單。我校申報的成果《興崇廉尚潔之風建風清氣正校園——四川醫(yī)科大學“清風校園”廉政文化建設活動紀實》獲得優(yōu)秀獎。

近年來，我校堅持將廉政文化建設納入學校黨風廉政建設和校園文化建設總體布局，以打造“立德樹人、風清氣正”的校園文化氛圍為目標，在全校范圍內(nèi)開展“清風校園”廉政文化建設活動，不斷加大廉政宣傳教育力度，強化廉政文化陣地建設，實施廉政文化精品工程，創(chuàng)新廉政文化載體形式，取得了明顯成績。

據(jù)悉，全國高校校園文化建設優(yōu)秀成果評選由教育部思政司負責組織實施，是我國高校校園文化建設成果的最高獎項，倍受教育行政部門和各高校的重視和關注。本屆“全國高校校園文化建設優(yōu)秀成果”，全國各高校共申報743項，經(jīng)專家嚴格評審和公示，共評出特等獎10項，一等獎30項，二等獎60項，優(yōu)秀獎106項。

Relationship between the expression of Survivin，P53，Bcl-2 and Bax，and radiosensitivity in laryngeal carcinoma

Li Leiji，Liu Yuehua，Gao Lin，Zhao Chong
Department of Otolaryngology-HNS，the First Affiliated Hospital of Sichuan Medical University

Objective:To investigate the expression of Survivin，P53，Bax and Bcl-2 in laryngeal epithelium, and to investigate the relationship between the expression of laryngeal epithelium and the sensitivity to radiotherapy.Methods:The expression of Survivin group，P53，Bcl-2 and Bax expression were detected in 56 cases of laryngeal cancer patients with radiotherapy paraffin specimens,and laryngeal precancerous lesions such as paraffin blocks of leukoplakia of the larynx and vocal cord polyp of normal laryngeal mucosa in 10 cases were compared,combined with the clinical data,1-5 year follow-up of all patients,the recurrence cases again the inspection organization,and detection of the four oncogene protein expression and initial test results and survival analysis was performed.Results:Survivin、P53、Bcl-2 showed low expression in vocal cord polyps,however，Bax showed a relatively high expression.Survivin，P53，Bcl-2 had a high expression in laryngeal carcinoma tissues, while Bax showed relatively low expression Of the 56 patients.Before radiotherapy，the rate is 82.1%,one year after the radiotherapy，three years and five years later,the detection rate of Survivin in laryngeal carcinoma tissues was 67.1%，53.9%and 32.8%，respectively.Statistically significant difference(P＜0.05).The expression rate of P53 before radiotherapy is 76.7%,which is reduced to 54.6%after 1 year,40.1%after 3 years，and 26.8%5 years later which were significantly different(P＜0.05).Bcl-2 before radiotherapy was80.1%,afterradiotherapy is 65.3%,42.1%,30.9%.Bax before radiotherapy is 52.4%,after radiotherapy it was respectively 49.3%,50.4%,47.7%,and there was no significant difference(P＞0.05).The expression of Survivin,P53,and Bcl-2 was positively correlated with the expression of Bax negatively.The positive cell rates of the expression of the four genes were correlated with the sensitivity of radiotherapy.Conclusion:the expression of Survivin,P53 and Bcl-2 in laryngeal cancer tissues with high expression,is sensitive to radiotherapy for laryngeal carcinoma patients with radiotherapy after inhibitor gene of apoptosis,Survivin,P53 and Bcl-2 showed the trend to reduce the rate of expression and Bax showed expression rates are on the rise trend,Survivin,P53,Bcl-2 and Bax gene as to judge the sensitivity of radiotherapy in patients with laryngeal cancer molecular marker has certain clinical application value.

Laryngealcarcinoma；Radiation sensitivtiry；Gene

R767.19

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.021

李雷激（1968-），男，副教授，E-mail：lileiji030@163.com