RhoGDI2基因抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移涉及基因和信號通路的生物信息學分析

唐勇李秀寧高超劉翰楠王琪

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科；2廣西醫(yī)科大學研究生學院；3廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；4區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（廣西醫(yī)科大學）

基礎研究

RhoGDI2基因抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移涉及基因和信號通路的生物信息學分析

唐勇1李秀寧2高超1劉翰楠1王琪3，4

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科；2廣西醫(yī)科大學研究生學院；3廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；4區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（廣西醫(yī)科大學）

目的 利用生物信息學方法探討RhoGTP酶GDP解離抑制因子2（rho GDP dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）基因抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移涉及的基因和信號通路。方法 從GEO datasets數(shù)據(jù)庫搜索膀胱癌轉(zhuǎn)移相關的全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)，使用GEO2R在線工具分析膀胱癌組織中RhoGDI2基因高表達組與低表達組之間的差異表達基因，再篩選出多組表達譜芯片數(shù)據(jù)中一致性上調(diào)或下調(diào)的基因，最后使用DAVID在線工具進行差異表達基因信號通路富集。結果 得到RhoGDI2基因在膀胱癌組織中高表達組和低表達組一致性高的差異表達基因，其中A2M、CORO1A、ENC1、FGD3為上調(diào)基因中一致性高的差異表達基因。通過基因信號通路富集分析得到膀胱癌組織中RhoGDI2基因調(diào)控的主要信號通路為Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK。結論 RhoGDI2基因可能通過Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK信號通路調(diào)節(jié)肌絲蛋白、細胞骨架以及細胞的增殖、分化等，進而抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移。

膀胱腫瘤；RhoGTP酶GDP解離抑制因子2；基因；信號通路；生物信息學

RhoGTP酶GDP解離抑制因子2（rho GDP dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）是RhoGTP酶的GDP解離抑制因子家族成員之一，主要功能是調(diào)節(jié)RhoGTP酶活性狀態(tài)的Rho-GTP和非活性狀態(tài)的Rho-GDP之間的循環(huán)［1］。在不同類型的腫瘤中，RhoGDI2基因的表達可上調(diào)或下調(diào)，如在卵巢癌、胃癌中的表達上調(diào)，在膀胱癌中的表達下調(diào)［2.3］。有研究發(fā)現(xiàn)，RhoGDI2基因與膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關，其表達隨膀胱癌臨床分期升高而下降，在非肌層浸潤型膀胱癌中的表達高于肌層浸潤型，在非轉(zhuǎn)移型膀胱癌中的表達高于轉(zhuǎn)移型［4，5］。在膀胱癌動物模型中也發(fā)現(xiàn)高表達RhoGDI2基因能夠抑制膀胱癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

生物信息學是近年來非常熱門的研究工具，廣泛應用于分子生物學各個領域，包括基因組序列信息和基因表達譜的分析、蛋白質(zhì)序列和結構及相互作用分析、代謝和疾病發(fā)生途徑的信號通路研究等［6，7］。本文采用生物信息學方法，挖掘RhoGDI2基因水平的信號通路和共同表達基因，探討RhoGDI2基因在膀胱癌轉(zhuǎn)移中的作用機制。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)庫檢索

在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中檢索膀胱癌轉(zhuǎn)移相關的全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)。檢索關鍵詞為膀胱癌（bladder cancer）。檢索條件如下：種屬為人類（homo sapiens）；芯片類型為表達譜芯片（expression profiling by array）。使用以下納入標準對檢索結果進行篩選：⑴必須是全基因組表達芯片；⑵樣本為膀胱癌組織；⑶同一基因芯片系列樣本中包含至少20例膀胱癌組織樣本；⑷樣本的患者未經(jīng)放化療。剔除每個基因芯片系列中正常對照或者癌旁樣本的芯片數(shù)據(jù)，以膀胱癌樣本的芯片數(shù)據(jù)作為研究對象。按照ARHGDIB基因（即RhoGDI2基因官方標注名稱）表達值的高低將芯片數(shù)據(jù)從高到低排序，ARHGDIB基因表達值最高和最低各10張芯片，分別作為RhoGDI2基因高表達組和低表達組。

1.2 差異表達基因的篩選

利用GEO2R在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/info/geo2r.html）分析膀胱癌組織中RhoGDI2基因高表達組和低表達組之間的差異表達基因。按以下標準篩選差異表達基因：⑴剔除基因表達值改變在1.5倍以上的芯片數(shù)據(jù)少于20%的基因；⑵剔除基因表達數(shù)據(jù)缺失值超過50%的基因。分析RhoGDI2基因高表達組和低表達組間差異表達基因以及一致性表達上調(diào)或下調(diào)的基因。

1.3 差異表達基因信號通路的富集

用PATHER在線工具（http：//www.pantherdb.org/）分析各個差異表達基因基因本體的細胞成分、分子功能和生物學過程。用DAVID在線工具進行KEGG差異表達基因信號通路的富集分析，綜合比對各組差異表達基因集的KEGG信號通路，選擇一致性高的信號通路進行具體分析。

2 結果

2.1 基因芯片數(shù)據(jù)的篩選

在NCBI的GEO datasets數(shù)據(jù)庫中找到符合納入標準的6套數(shù)據(jù)，共計685例膀胱癌組織的全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)，具體信息見表1。

2.2 多個基因芯片系列間差異表達基因的篩選

分析符合納入標準的6套數(shù)據(jù)，得到各套數(shù)據(jù)差異表達基因中上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)目（表2），對其進行交叉比對，在ARHGDIB基因表達上調(diào)的膀胱癌樣本中，A2M、CORO1A、ENC1、FGD3基因在5套基因芯片系列中的表達均升高，在下調(diào)的差異表達基因中，RAP1GDS1、RPRD1A基因在4個基因芯片系列中的表達均下降。

用PATHER在線工具分析 A2M、CORO1A、ENC1、FGD3基因本體的細胞成分、分子功能和生物學過程。這4個基因涉及的細胞成分主要包括：細胞骨架和鳥嘌呤核苷酸交換因子GEF；分子功能包括：細胞骨架的調(diào)節(jié)，肌絲蛋白結合活性及催化酶、肽酶、GTP酶、細胞因子的活性調(diào)節(jié)等；生物學過程主要包括：細胞活動及代謝過程，細胞骨架的形成及發(fā)展過程等。總的來說，上調(diào)的這4個基因主要涉及細胞運動和RhoGTP酶活性的調(diào)節(jié)。

2.3 差異表達基因信號通路富集結果

將6個基因芯片系列的差異表達基因分別導入DAVID在線工具進行信號通路富集分析，得到該差異表達基因集上調(diào)和下調(diào)基因主要集中的KEGG通路，將這些信號通路集進行比對，得到一致性高的共同信號通路。上調(diào)的差異表達基因主要富集在白細胞穿過內(nèi)皮遷移、病毒性心肌炎、細胞黏附分子、小細胞肺癌等共同相關功能和疾病的信號通路。見表3。而下調(diào)的差異表達基因主要富集在纈氨酸/亮氨酸和異亮氨酸降解、阿爾茨海默病等共同相關功能和疾病的信號通路。見表4。

表1 符合納入標準的膀胱癌組織全基因組表達譜芯片系列信息

表2 6套膀胱癌基因芯片系列差異表達基因數(shù)目（個）

表4 KEGG通路分析下調(diào)的差異表達基因共同相關功能與疾病的信號通路

表3 KEGG通路分析上調(diào)的差異表達基因共同相關功能和疾病的信號通路

3 討論

本研究應用生物信息學的方法探討RhoGDI2基因在抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移中涉及的基因和信號通路。首先篩選出膀胱癌組織中RhoGDI2基因高表達組與低表達組之間的差異表達基因，然后對差異表達基因進行比對和信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的差異表達基因主要富集在白細胞穿過內(nèi)皮遷移、病毒性心肌炎、細胞黏附分子、小細胞肺癌等共同相關功能和疾病的信號通路。腫瘤的轉(zhuǎn)移過程包括腫瘤細胞與原發(fā)病灶黏附力下降、細胞外基質(zhì)降解、腫瘤細胞遷移和穿越血管內(nèi)皮運動等，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中機體會產(chǎn)生免疫反應。RhoGDI2基因可能通過以上的信號通路影響腫瘤轉(zhuǎn)移過程的各個環(huán)節(jié)。

Rho家族蛋白是G蛋白偶聯(lián)的Ras超家族成員［8］。RhoGDI2基因調(diào)節(jié)RhoGTP酶活性狀態(tài)的過程主要涉及三類分子：鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs），GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）和GDP解離抑制因子（GDP dissociation inhibitors，GDIs）［9］。RhoGDI2基因可以通過信號通路中的RhoGDI2酶（主要是Rho、Rac、Cdc42）或者Ras發(fā)揮作用。本文研究結果顯示，上調(diào)的差異表達基因主要富集的共同相關功能和疾病的信號通路中有8條涉及RhoGTP酶或Ras蛋白。

這8條共同相關功能和疾病的信號通路具體如下：⑴在穿越血管內(nèi)皮運動中，有調(diào)節(jié)肌絲蛋白的Vav-RhoA-ROCK-MLC信號通路和調(diào)節(jié)細胞運動的PI3KVav-Cdc42/Rac1/Rac2信號通路，調(diào)控節(jié)點為Vav。同時還有RhoGAP-RhoA-ROCK-MLC肌絲蛋白/肌動蛋白調(diào)節(jié)通路，調(diào)控節(jié)點為RhoA。⑵在血管平滑肌收縮功能中，有Gα12/13-RhoGEF-RhoA-ROCK-MLC/MHC血管收縮信號通路，調(diào)控節(jié)點為ROCK。⑶在黏著斑相關信號通路中，有ECM與受體相互作用-PKC/SRCFAK-RhoGAP/RhoGEF-RhoA-ROCK-MLC/mDia1的肌絲蛋白調(diào)節(jié)通路和FAK-P13K-PIP3-Rac/Cdc42-PAK的肌絲蛋白和細胞增殖調(diào)節(jié)通路，調(diào)控節(jié)點為信號通路上游的FAK、Src和下游的RhoA、PAK、MLC。⑷在T細胞受體信號通路中，有調(diào)控免疫反應、細胞增殖、分 化功能 的 MHC-ZAP70-SOS-RasGRP1-Ras-Raf-MEK-AP1信號通路，調(diào)控節(jié)點為ZAP70。⑸在B細胞受體信號通路中，有調(diào)節(jié)肌絲蛋白骨架的LYN-BTKBLNK-Vav-Rac信號通路，調(diào)控節(jié)點為BLNK、BTK；還有調(diào)節(jié)免疫產(chǎn)物表達和B細胞活化的BLNKRasGRP3-Ras-Raf-MEK-AP1-IG信號通路，調(diào)控節(jié)點為BLNK、RasGRP3。⑹在FcγR介導的吞噬作用中，有調(diào)節(jié)肌絲骨架的抗原-IgG-Syk-Vav-Rac-PAK1信號通路，調(diào)控節(jié)點為Syk、Rac。⑺在肌絲蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)通路中，有趨化因子-Ras-Raf-MEK-ROCK-MLC和趨化因子-Ras-PI3K/Rac1GEF-Rac-Cdc42信號通路，還有與肌絲蛋白聚合功能及基因表達相關的趨化因子-RhoGEF-Rho-ROCK-MLC信號通路，其中最重要調(diào)控節(jié)點為Rac、ROCK，其次是Rho。⑻在腫瘤信號通路中調(diào)控細胞增殖運動的有細胞因子與受體相互作用-Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路，其中重要調(diào)控節(jié)點為Ras；還有調(diào)控組織侵襲和轉(zhuǎn)移功能的Thrombin-RhoGEF-Rho-ROCK信號通路，其中重要調(diào)控節(jié)點為Rho。

以上信號通路中Rho、Rac、Cdc42是多個信號通路的調(diào)控節(jié)點，影響細胞的多種功能。這些信號通路的終端效應與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程的細胞運動、機體免疫等密切相關。其中以調(diào)節(jié)肌絲蛋白功能的Vav-RhoA-ROCK-MLC信號通路最為常見，其次為Ras-Raf-MEK信號通路。關鍵調(diào)控節(jié)點一致性較高的下游因子有ROCK、mDia1、PAK、MEK、AP1、MLC等，一致性較高的上游因子主要有 Vav、FAK、Src、P13K、PIP3等。

對信號通路中關鍵調(diào)控節(jié)點一致性較高的下游因子和上游因子進行分析。Rho激酶（Rho associated kinases，ROCK）是Rho蛋白的主要效應分子，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［10］，可磷酸化激活，其表達升高與膀胱癌轉(zhuǎn)移呈正相關［11］。mDia1屬于成蛋白（formin）相關蛋白家族，可通過集結和聚合作用生成肌絲，同時作為Rho介導的肌絲骨架調(diào)節(jié)通路的下游因子，可能參與Src介導的腫瘤細胞遷移和黏著斑重塑［11］。p21激酶（p21-activated kinase，PAK）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可結合并促進RhoGDI2磷酸化，其活性受Rac和Cdc42及其他因子調(diào)節(jié)。Rac1的激活對PAK誘導RhoGDI2磷酸化起正反饋作用，并與細胞遷移相關［12］。絲裂原細胞外激酶（mitogen extracellular kinase，MEK）在Ras-Raf-MEK-ERK信號通路中發(fā)揮重要作用，在膀胱癌中可通過Ras-MAPK信號通路影響膀胱癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移［13］。激活蛋白-1（activating protein-1，AP1）是由原癌基因Fos和Jun蛋白組成的異源二聚體，構成亮氨酸拉鏈［14］。AP1調(diào)節(jié)靶基因的表達可以產(chǎn)生細胞增殖、分化、炎癥、宿主反應和惡變等效應，而AP1活性降低可影響抑癌基因p53及細胞周期調(diào)控基因p21的表達，p53和p21基因表達的下降使細胞生長及增殖受到抑制、細胞凋亡［15］。肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（myosin light-chain，MLC）是肌絲蛋白調(diào)節(jié)的中間環(huán)節(jié)。Vav屬于GEFs之一，主要功能是調(diào)節(jié)RhoGTP酶的活化，在腫瘤生成中發(fā)揮重要作用［16］。聚集黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是整合蛋白介導的信號傳導過程中的關鍵酶，與細胞惡變、分化、浸潤相關，在膀胱癌癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，在浸潤性癌中的表達陽性率明顯高于非浸潤性癌，F(xiàn)AK的表達升高有助于膀胱癌細胞的增殖和遷移［17］。P13K是細胞內(nèi)重要的信號傳導分子，P13K激活PIP3，進一步引起下游效應因子活化。

在膀胱癌中關于RhoGDI2基因與Rac1、Src相關關系的研究較多。RhoGDI2特異性結合Rac1，以不同腫瘤類型依賴的方式正向/負向調(diào)節(jié)其活性，進而調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Rac1的活性增加與抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移相關［18］。Src能與RhoGDI2結合，磷酸化RhoGDI2的特定酪氨酸殘基。磷酸化后的RhoGDI2與RhoA、Rac1和Cdc42結合能力減弱，抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移的功能受到影響［19］。Src的表達與膀胱癌分期和RhoGDI2基因的表達均呈負相關，提示二者可能涉及相同的信號傳導通路［20］。

本研究結果提示RhoGDI2基因在膀胱癌的轉(zhuǎn)移中可能通過Vav-RhoA-ROCK-MLC和Ras-Raf-MEK等信號通路發(fā)揮作用，這些信號通路主要參與調(diào)節(jié)肌絲蛋白和細胞骨架以及細胞的增殖、分化等。有關方面仍需進一步實驗驗證。

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［2014-12-19收稿］［2015-01-28修回］［編輯 游雪梅］

Bioinformatic analysis of genes and signaling pathways associated w ith RhoGDI2-inhibited bladder cancer metastasis

TANG Yong1，LIXiuning2，GAO Chao1，LIU Hannan1，WANG Qi3，4（1Department of Urology Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University；3Research Department of Guangxi Cancer Institute；4Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Prevention Treatment（Guangxi Medical University），Ministry of Education，Nanning 530021，P.R.China）

WANG Qi.E-mail：qi_catcat@163.com

Objective This study used bioinformatics to examine the genes and signaling pathways associated with RhoGDP dissociation inhibitor 2（RhoGDI2）inhibits bladder cancermetastasis.M ethods Six datasets from genomic microarray studies of patients with metastatic bladder cancer were downloaded from the Gene Expression Omnibus database.On-line GEO2R tools were used to screen for genes differentially expressed between individuals expressing low or high levels of RhoGDI2.On-line DAVID tools were used to map differentially expressed genes to signaling pathways.Result The genes A2M，CORO1A，ENC1，and FGD3 were expressed at higher levels in patients expressing high levels of RhoGDI2.RhoGDI2 appeared to influence the RhoA-ROCK-MLC and Ras-Raf-MEK signaling pathways to the greatest extent.Conclusion RhoGDI2 may act via the RhoA-ROCK-MLC and Ras-Raf-MEKpathways to regulate cytoskeleton，cell proliferation，differentiation and metastasis in bladder cancer.

Bladder neoplasm；Rho GDP dissociation inhibitor 2；Gene；Signaling pathways；Bioinformatics

R737.14

A

1674-5671（2015）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.04

國家自然科學基金資助項目（81360341）；廣西自然科學基金資助項目（2011GXNSFC018020,2012GXNSFAA053163）

王琪。E-mail：qi_catcat@163.com

李秀寧為共同第一作者。