半滑舌鰨體表潰瘍病病原的分離鑒定?

徐曉麗, 邵 蓬， 李賀密， 姚學(xué)良， 鄭艷坤， 包海巖

(天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300221)

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研究簡報

半滑舌鰨體表潰瘍病病原的分離鑒定?

徐曉麗, 邵 蓬， 李賀密， 姚學(xué)良， 鄭艷坤， 包海巖??

(天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300221)

為研究引起半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)體表潰瘍病的病原，從發(fā)生體表潰瘍的半滑舌鰨體表病灶、肝臟和腎臟上進(jìn)行細(xì)菌分離，得到2株優(yōu)勢菌株051001和051002，采用腹腔注射進(jìn)行回感實(shí)驗(yàn)，證實(shí)菌株051001和051002能夠引起養(yǎng)殖半滑舌鰨發(fā)病死亡，該菌株為本次半滑舌鰨體表潰瘍病的致病菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性分析，初步判定菌株051001為魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)、菌株051002為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)；基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株051002與哈維氏弧菌聚為一支，菌株051001與魚腸道弧菌聚為一個分支；基于hsp60的基因序列分析表明051002與哈維氏弧菌(AY332570、AF230931)聚為一個分支，置信度為92%。對16種藥物的敏感實(shí)驗(yàn)證實(shí)，菌株051001對利福平、慶大霉素、氟苯尼考等敏感，菌株051002對諾氟沙星、頭孢曲松鈉、慶大霉素敏感。

半滑舌鰨;體表潰瘍病；弧菌;病原鑒定;藥敏實(shí)驗(yàn)

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)俗稱鰨目、鰨米，隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)舌鰨科(Cnoglossidae)舌鰨屬(Cynoglossus)，主要分布于中國黃渤海海域，東海、南海、朝鮮半島及日本海域也有分布。半滑舌鰨是鲆鰈類養(yǎng)殖中的珍貴品種，因味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者青睞，市場價格居高不下。因苗種規(guī)?；斯し庇夹g(shù)的突破，半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖在中國沿海地區(qū)迅速興起并形成產(chǎn)業(yè)，已成為河北、天津沿海海水養(yǎng)殖魚類的主導(dǎo)魚種。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，各種疾病也隨之發(fā)生，其中體表皮膚潰瘍病是近年來嚴(yán)重危害天津地區(qū)半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種疾病。該病全年均有發(fā)生，各齡魚均可發(fā)病，病程緩慢，全市各半滑舌鰨養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖池均有不同程度的發(fā)病病魚。病魚的癥狀主要表現(xiàn)為鰭基部出血、潰爛，體表潰瘍，潰瘍處不斷擴(kuò)大形成潰爛，病魚不食，最終死亡；部分癥狀較輕的病魚，會有自愈現(xiàn)象，但在潰爛處會留下明顯的疤痕，影響其商品價值。因體表皮膚潰瘍病的導(dǎo)致半滑舌鰨的產(chǎn)量急劇下降，經(jīng)濟(jì)損失巨大，這已影響到半滑舌鰨產(chǎn)業(yè)在天津地區(qū)的存亡和發(fā)展。

對于半滑舌鰨的體表潰瘍癥，國內(nèi)已有學(xué)者對其進(jìn)行了研究：陳政強(qiáng)等[1-2]從患病半滑舌鰨體內(nèi)分離到2株弧菌鑒定為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和輪蟲弧菌(V.rotiferianus)，人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)2株菌均可獨(dú)立引起半滑舌鰨發(fā)病死亡，且具有較強(qiáng)毒性；張曉君等[3]從鰓蓋及鰭基出血、尾鰭腐爛的半滑舌鰨病魚肝臟、腹水中分離到大量優(yōu)勢生長的鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)；王燕[4]等認(rèn)為該病的病原為美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.Piscicida)；但也有學(xué)者從潰爛的體表部位分離到了假單胞菌屬細(xì)菌。本研究取患病半滑舌鰨進(jìn)行病原分離，得到2株優(yōu)勢菌株，采用形態(tài)學(xué)、生化特性分析結(jié)合16S rRNA及hsp60基因?qū)λ蛛x的菌株進(jìn)行鑒定，并對其致病性及藥物敏感性進(jìn)行分析，旨在探究天津地區(qū)半滑舌鰨潰瘍病的發(fā)病病原及其特性，為該病的診斷與防治提供科學(xué)參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患病半滑舌鰨取自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，發(fā)病魚體長15～25cm，體表及鰭已形成明顯潰爛。健康半滑舌鰨30尾取自天津興盛海淡水養(yǎng)殖公司，體長(15±2) cm，體質(zhì)量(35±3) g，暫養(yǎng)于75L水族箱，采用充氣泵增氧，每天投餌2次，吸污1次，實(shí)驗(yàn)期間保持養(yǎng)殖水溫25℃，鹽度2。2216E、TSB、TCBS培養(yǎng)基、弧菌科細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離

取體表潰爛癥狀典型的半滑舌鰨，刮取體表黏液、鰓及潰爛處組織等在顯微鏡下檢查是否有寄生蟲和真菌。用酒精棉球擦拭病魚尾部，用2.5mL無菌注射器從病魚尾靜脈取血0.5mL，并迅速將所取的血液涂布于2216E平板；取接種環(huán)從體表潰爛處深處接種細(xì)菌，劃線接種于2216E平板；無菌操作取病魚的肝、脾、腎等部位，加入滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)研磨，取研磨液劃線接種于2216E平板，25℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)菌株，以TSB凍存液(含15%甘油的TSB培養(yǎng)基)保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染實(shí)驗(yàn)

感染實(shí)驗(yàn)用半滑舌鰨飼養(yǎng)于45L玻璃缸中，分3組，每組10尾，其中2組為實(shí)驗(yàn)組，注射不同菌株，1組為對照組。

感染實(shí)驗(yàn)用菌株于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，用無菌PBS洗滌3次，以含0.85% NaCl的生理鹽水，將用于感染實(shí)驗(yàn)的2株菌懸液的密度調(diào)整為3×107cfu/mL。感染實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射方式進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組每尾舌鰨注射0.1mL菌液，對照組注射等量無菌PBS。注射后連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)魚，每天正常飼養(yǎng)并換水吸污，記錄半滑舌鰨的發(fā)病和死亡情況，并從人工感染發(fā)病的瀕死魚中，取患病癥狀與自然患病魚相似的再次分離、純化細(xì)菌。

1.4 病原分離與生理生化鑒定結(jié)果

將純化的細(xì)菌劃線接種于2216E和TCBS平板，28℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。挑取單菌落接種于生化鑒定管中，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[6]進(jìn)行細(xì)菌理化特性鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

模板DNA的制備 挑取純培養(yǎng)的待測細(xì)菌單菌落，懸浮于50μL無菌去離子水中，沸水煮5min，冰上冷卻后瞬時離心，取上清液作為PCR反應(yīng)的模板。

基因序列的PCR擴(kuò)增與測序 16S rRNA基因序列的擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行。hsp60基因序列的擴(kuò)增參照李寧求等[8]的方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物回收后直接送至天津華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

16S rRNA 和hsp60基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序所得分離菌的16S rRNA和hsp60基因序列提交至Gene Bank數(shù)據(jù)庫中，通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析。選取與所得菌株同源性較高的菌株的基因序列，采用Clustal x 1.81軟件比對后，分別以16S rRNA和hsp60為分子標(biāo)記，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件Mega 5.2基于鄰接法(Neighbor-joining，NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstraps進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)集1000次。

1.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

采用藥敏紙片法分析所分離菌株的藥物敏感性，以無菌棉簽分別蘸取密度為1.5×108cfu/mL菌液均勻涂布于平板，用無菌鑷子將藥敏紙片均勻貼在平板培養(yǎng)基表面，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑(mm)，并按照藥敏紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病魚檢查結(jié)果

患病的半滑舌鰨不食，反應(yīng)遲鈍，游泳無力，體表皮膚背負(fù)面有不同大小的潰瘍、潰爛面，鰭基部出血、潰爛，有的病魚腹部膨大內(nèi)有腹水，腸道鼓出幾乎脫出肛外，腸壁薄內(nèi)充液體，解剖發(fā)現(xiàn)病魚肝臟發(fā)白或充血發(fā)紅，腸道無食，膽囊腫大。取鰓、體表黏液及病變組織制作水浸片顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)真菌及寄生蟲。

圖1 患病的半滑舌鰨癥狀

2.2 病原分離及常規(guī)鑒定結(jié)果

從病魚血液、內(nèi)臟研磨液、體表潰爛深處分離到2株優(yōu)勢菌株，編碼051001、051002。菌株051001在TCBS培養(yǎng)基上形成圓形光滑、邊緣整齊的黃色菌落，菌落直徑約為1mm，呈革蘭氏陰性短桿狀，菌體長1～3μm，無莢膜(見圖2a)，具運(yùn)動性，發(fā)酵型代謝，V-P反應(yīng)陰性，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，β-半乳糖苷酶、淀粉酶、明膠酶、尿酶均為陰性，對O/129(150μg)敏感，能夠利用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖等，不能利用檸檬酸鹽、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、水楊苷、纖維二糖等(見表1)。菌株051001的生化特性與魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)較為一致，初步判定菌株051001為魚腸道弧菌。菌株051002在TCBS培養(yǎng)基上形成圓形、光滑濕潤、中心略隆起的深黃色菌落，直徑約1.5mm，呈革蘭氏陰性短桿狀，菌體長2～4μm，無莢膜(見圖2b)，具運(yùn)動性，發(fā)酵型代謝，V-P反應(yīng)陰性，還原硝酸鹽，產(chǎn)生吲哚，β-半乳糖苷酶陰性，淀粉酶、明膠酶、尿酶均為陽性，對O/129(150μg)敏感，賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶均為陽性，能夠利用甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、糊精、纖維二糖等，不能利用蔗糖、山梨醇、肌醇、阿拉伯糖、蜜二糖等(見表1)。菌株051002的生化特性與哈維氏弧菌(V.harveyi)較為一致，初步判定菌株051002為哈維氏弧菌。

圖2 菌株051001和051002的菌體形態(tài)Fig.2 The morphous of 051001 and 051002 strains

表1 菌株051001、051002的生理生化特性鑒定結(jié)果

注：+： 陽性； -： 陰性；S： 敏感；F： 發(fā)酵型；d： 菌株間不穩(wěn)定反應(yīng)。

Note: +： Positive; -： Negative; S： Sensitive; F： Fermentation; d： Sometimes negative, sometimes positive.

2.3人工感染實(shí)驗(yàn)

以純培養(yǎng)的菌株051002菌液感染健康的半滑舌鰨，感染結(jié)果如下：在感染3d后注射部位開始掉鱗，出現(xiàn)小白點(diǎn)；6d后形成小的潰瘍，被感染魚游動緩慢，很少吃食；11d后部分魚腹部出現(xiàn)隆起，潰瘍處有紅色出血點(diǎn)；19d后被感染魚開始出現(xiàn)死亡，潰瘍面擴(kuò)大；33d后被感染魚全部死亡，感染死亡的病魚，體表皮膚有明顯潰瘍，有的有腹水，腸道無食，與自然感染癥狀相似。以純培養(yǎng)的菌株051001菌液感染健康的半滑舌鰨，初期在注射部位有輕微掉鱗，繼而鰭周邊出現(xiàn)出血潰爛點(diǎn)，魚不食，第26天開始出現(xiàn)死亡，至第35天感染實(shí)驗(yàn)結(jié)束，死亡6尾魚，整個感染實(shí)驗(yàn)病情發(fā)展相對緩慢，爛鰭程度與自然發(fā)病魚相比較輕。而對照組無一死亡，未表現(xiàn)出明顯異常(見表2)。從人工感染后發(fā)病的瀕死魚內(nèi)臟及腹水接菌劃線于TCBS平板，得到與感染用菌株形態(tài)一致的黃色菌落，新分離株的理化特性與原感染菌一致。

表2 菌株051001、051002的人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Note： ①Bacterial concentration；②Dose；③Total No；④Death No；⑤Mortality；⑥Control

2.4 16S rRNA 和hsp60基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對所分離菌株051001、051002進(jìn)行了16S rRNA基因序列擴(kuò)增，得到1500bp的核酸片段。將測序所得序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示：菌株051001與魚腸道弧菌(DQ003270)的16S rRNA基因序列高度一致，相似度為98.03%；菌株051002與哈維氏弧菌、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)、鯊魚弧菌(V.carchariae)等的16S rRNA基因序列相似度均在99%以上。以16S rRNA基因?yàn)檫z傳標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：菌株051001與魚腸道弧菌聚為一支，置信度為99%；菌株051002與哈維氏弧菌聚為一支，但置信度不高(見圖3)。以hsp60基因序列為遺傳標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株051002與哈維氏弧菌(DQ279071)聚為一個分支，置信度為92%(見圖4)。結(jié)合菌株生理生化特性與16S rRNA及hsp60基因序列的分析結(jié)果，判定菌株051001為魚腸道弧菌，菌株051002為哈維氏弧菌。

圖3 以16S rRNA基因構(gòu)建的弧菌屬細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 以hsp60基因構(gòu)建的V. harveyi系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

使用16種抗生素對菌株051001、051002進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。菌株051001對利福平、氟苯尼考、慶大霉素等敏感，對諾氟沙星、恩諾沙星中毒敏感，對磺胺異惡唑、呋喃唑酮青霉素等具有抗性；菌株051002對諾氟沙星、頭孢曲松鈉、慶大霉素敏感，對阿奇霉素中度敏感，對氟苯尼考、恩諾沙星等具有抗性，2株菌株均對慶大霉素敏感。

表3 菌株051001、051002的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：S表示敏感 Sensitive；R表示抗性Resistant；I表示中度敏感 Intermediate。

①Roxithromycin；②Doxycycline；③Enrofloxacin；④Sulfafurazole；⑤Rifampicine；⑥Furazolidone；⑦Florfenicol；⑧Novobiocin；⑨Streptomycin；⑩G Penicillin；Azithromycin；Norfloxacin；Rocephin；Gentamicinum；Furazolidone；Amikacin

3 討論

魚類體表潰瘍病是養(yǎng)殖魚類的多發(fā)疾病，牙鲆(Paralichthysolivaceus)、香魚(Plecoglossusaltivelis)、許氏平鲉(sebastesschlege/i)、石斑魚、紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、花鱸(Lateolabraxjaponicus)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)、鮸魚(Miichthysmiiuy)等都有過報道。目前，從發(fā)生體表潰瘍病的病魚體內(nèi)先后分離到鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)、哈維氏弧菌、魚腸道弧菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、鰤魚諾卡氏菌(Nocardiaseriolea)、海洋屈撓桿菌(Tenacibaculummaritimum)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)等[1-4,7-8,16-20]。本研究從患體表潰瘍病的半滑舌鰨體表和體內(nèi)同時分離到哈維氏弧菌和魚腸道弧菌，人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)該2株菌可引起半滑舌鰨發(fā)生體表潰癢、爛鰭等癥狀，進(jìn)一步證實(shí)該病可能是由多種病原感染引起[21]。本次人工感染實(shí)驗(yàn)的病魚病情發(fā)展緩慢，致死性不強(qiáng)，與自然狀態(tài)下半滑舌鰨體表潰瘍病病程長、死亡率不高相一致。張正[22]通過對感染皮膚潰瘍病的半滑舌鰨的組織病理學(xué)研究，認(rèn)為導(dǎo)致病魚死亡的最終原因是在體表顯著的病變特征出現(xiàn)之前，病魚的多個組織器官可能已經(jīng)被病原感染，而病變使器官的功能衰竭以及全身的血液循環(huán)障礙，并逐漸喪失正常的生理代謝。這解釋了自然或人工感染狀態(tài)下，半滑舌鰨體表潰瘍病發(fā)病周期長，并未出現(xiàn)大規(guī)模急性死亡的原因。

在對本研究所分離出的菌株進(jìn)行鑒定過程中，采用了最常用的16S rRNA基因序列分析，一般認(rèn)為16S rRNA基因同源性大于97.5%的細(xì)菌菌株可視為同種[23]。本研究中，菌株051002與哈維氏弧菌、輪蟲弧菌、鯊魚弧菌等的16S rRNA基因序列相似度均在99%以上，不能確定該菌種的分類地位。熱激蛋白hsp基因是另一種常用于生物進(jìn)化及分類的大分子物質(zhì)，進(jìn)化速度比16S rRNA快，在系統(tǒng)進(jìn)化中相對保守且在不同種間具有足夠的多態(tài)性，廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌的分類鑒定，Kwok等的研究表明hsp60基因適合用于研究海洋弧菌系統(tǒng)分類[24]。本研究擴(kuò)增了菌株051002的hsp60基因并構(gòu)建了以hsp60為遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示051002與哈維氏弧菌聚為一支，具有較高的置信度。由此結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、生化特性及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，判定菌株051001為魚腸道弧菌，菌株051002為哈維氏弧菌。

對于半滑舌鰨體表潰瘍癥狀的治療，最常用的措施還是施用抗生素。本研究采用藥敏紙片法分析了所分離菌株對16種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示2株菌株同時敏感的藥物僅有慶大霉素，而在國標(biāo)漁藥中僅有注射用復(fù)方硫酸慶大霉素可用于親魚產(chǎn)后康復(fù)或河蚌育珠，并無慶大霉素直接用于食用魚類的許可。2株菌對水產(chǎn)常用甚至不用的抗生素具有不同程度的抗性，也提示了大量使用抗生素所造成的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及環(huán)境中抗生素的污染。鑒于半滑舌鰨體表潰瘍病發(fā)病周期長，因此在生產(chǎn)上對于這種疾病還是應(yīng)以預(yù)防為主，日常管理中經(jīng)常觀察池中魚的生理狀態(tài)變化，及時撿出活力弱或攝食不佳的魚隔離飼養(yǎng)，采取有效的消毒措施，降低養(yǎng)殖密度，使用免疫增強(qiáng)劑增強(qiáng)魚的體質(zhì)，減少魚體應(yīng)激，倒池時小心操作盡量避免魚體受傷，這些措施均能夠降低該病的暴發(fā)機(jī)率。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Isolation and Identification of the Pathogens of the Skin Ulceration Disease ofCynoglossussemilaevis

XU Xiao-Li, SHAO Peng, LI He-Mi, YAO Xue-Liang, ZHENG Yan-Kun, BAO Hai-Yan

(Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221, China)

The aims of this research were to isolate the pathogens of the skin ulceration disease ofCynoglossussemilaevisand to identify the sensitivity to antibiotics. Two dominant bacterial strains documented as 051001 and 051002 were isolated from the skin, liver and kidney of dyingC.semilaevis. Both strains could cause the mortality of healthyC.semilaevisindependently in artificially challenge and were proved to be pathogens ofC.semilaevis. Based on the results of morphological observation, physio-logical and biochemical characterization and 16S rRNA gene sequence, strain 051001 was identified asVibrioichthyoenteriand strain 051002 wasV.harveyi. Phylogenetic tree ofVibriobased onhsp60 gene indicated that strain 051002 showed the highest level of similarity toV.harveyi, and the bootstrap was 92%. Antibiotic sensitivity analysis showed that strain 051001 was susceptible to rifampicine, florfenicol, furazolidone, gentamicinum and streptomycin; while strain 051002 was susceptible to norfloxacin, rocephin and gentamicinum.

Cynoglossussemilaevis; skin ulceration disease;Vibrio; pathogen identification; antibiotic sensitivity analysis

天津市科技支撐計劃項(xiàng)目(12ZCZDNC00900)；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(13ZXNZNC07700)資助

2014-07-03；

2014-09-11

徐曉麗(1983-)，女，工程師，研究方向：水產(chǎn)動物病害學(xué)。E-mail: xiaolixu1983@gmail.com

??通訊作者： E-mail: scjstgz688@163.com

S 941.41+7

A

1672-5174(2015)11-029-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140217