鼠曲草醇提物改善慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥的實(shí)驗(yàn)研究

葉向麗　廖海偉　李煌

【摘要】目的：研究鼠曲草醇提物對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥的影響。方法：采用氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）加煙熏法建立COPD大鼠模型，造模后第15 日開始藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，計(jì)算肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的比例；采用ELISA法測(cè)定BALF中IL-8和TNF-α濃度；同時(shí)采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠肺組織中IL-8、TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組相比，鼠曲草醇提物組明顯減少大鼠BALF中白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比（P<0.05），而淋巴細(xì)胞百分比無顯著性差異。與模型組相比，鼠曲草醇提物組明顯降低大鼠BALF中IL-8、TNF-α濃度（P<0.05），同時(shí)鼠曲草醇提物組能夠顯著下調(diào)肺組織中IL-8、TNF-α mRNA的表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論：鼠曲草醇提組可降低COPD大鼠BALF中白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比，降低COPD大鼠BALF中細(xì)胞因子IL-8和TNF-α的濃度及mRNA表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】 鼠曲草醇提物；慢性阻塞性肺疾??；IL-8；TNF-α

【中圖分類號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）19-0005-03

Abstract：Objective To study the effect of ethanol extract of Gnaphalium affine on inflammation of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） model rats. Methods The COPD model was established by smoking and infusing lipopolysaccharide （LPS）. After 15 days， the rats were given the drugs by orally taking once a day. Ratio of macrophage， neutrophile granulocyte and lymphocytes in BALF cells were evaluated by cytometry. The level of IL-8， TNF-α in BALF were measured by ELISA. Futhermore， the level of IL-8， TNF-α in lung tissue were analysed by RT-PCR. Results Compared with the model group， ethanol extract of Gnaphalium affine obviously reduced the ratio of leukocyte， macrophage and neutrophile granulocyte in BALF cells （P<0.05）， but the ratio of lymphocytes had no significant difference. Compared with the model group， ethanol extract of Gnaphalium affine obviously decreased the level of IL-8， TNF-α in BALF， as well as the level of IL-8， TNF-α in lung tissue （P<0.05）. Conclusion Ethanol extract of Gnaphalium affine has protective effect on lung tissue of COPD rats， and can adjust the level of IL-8， TNF-α， which may be one of its mechanisms of intervening occurrence and development of COPD.

Keywords：COPD；Gnaphalium affine；IL-8；TNF-α

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展。COPD是呼吸系統(tǒng)常見病，多發(fā)病， 常與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其死亡率居全球所有死亡原因的第4位[1]。COPD已成為當(dāng)今嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題并成為國(guó)內(nèi)外呼吸界關(guān)注的熱點(diǎn)?，F(xiàn)代研究認(rèn)為慢性、持續(xù)性氣道炎癥是COPD發(fā)生和發(fā)展的主要病理機(jī)制之一，它與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。細(xì)胞因子IL-8、TNF-α作為主要的炎癥遞質(zhì)參與了COPD氣管炎癥的全過程。

鼠曲草為菊科植物鼠曲草Gnaphalium affine D.Don 的全草，別名佛耳草、追骨風(fēng)、絨毛草、清明菜等。始載于《名醫(yī)別錄》。《本草綱目》謂其主“寒熱， 除肺中寒，大升肺氣”，具有化痰止咳、祛風(fēng)平喘之效。已收載于《中華人民共和國(guó)藥典》1977年版一部中。其治療呼吸道疾病療效已被報(bào)道[2-3]。本研究旨在探討鼠曲草的醇提物對(duì)COPD模型大鼠氣道炎癥的影響。

1 材料

1.1 藥物 鼠曲草購自于亳州市清逸中藥材科技有限公司，經(jīng)鑒定為菊科植物鼠曲草Gnaphalium affine D.Don 的全草。取其全草，粉碎成粗粉，加入藥材10倍量50%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋成0.1 g/ml的藥液，備用。

1.2 儀器與試劑 恒溫水浴鍋（HH-6型，國(guó)華電器有限公司）；低溫冷卻循環(huán)泵（DLSB-5/40型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52型，上海亞榮生化儀器廠）；全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（POCH-100IV diff，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司）；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（TECAN，Infinite M200 Pro）。脂多糖（LPS，批號(hào)L-2880，Sigma 公司）；無水乙醇（AR；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；大鼠IL-8、TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒（美國(guó)RapidBio（進(jìn)口分裝）；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠60只，8周齡，體重180～220g，雄性，購買自福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)200700518642。

2 方法

2.1 大鼠COPD模型的制備 采用市售七匹狼牌過濾嘴香煙，按文獻(xiàn)[3]復(fù)制COPD模型。將60只大鼠隨機(jī)分為正常組（10只）、模型組（25只）、鼠曲草醇提物組（25只）。除正常組外，將模型組、鼠曲草醇提物組大鼠分別置于60cm×45cm×55cm 有機(jī)玻璃吸煙箱，每個(gè)有機(jī)玻璃箱內(nèi)放置10只大鼠，每天上午、下午被動(dòng)吸煙各1次，每次放置5只香煙，燃盡后更換，持續(xù)30分鐘，每周吸煙6 d，連續(xù)1個(gè)月，第30天吸完煙后將大鼠處死。同時(shí)除正常組外，分別于第1 d和第14 d向?qū)⒛Ｐ徒M、鼠曲草醇提物組大鼠氣管內(nèi)注入LPS（0.1 mg/100g）。

2.2 給藥 從造模第15 日起，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行灌胃干預(yù)治療，正常組、模型組給予等體積生理鹽水，鼠曲草醇提物組給予0.1g/100g（原藥材/大鼠體重），每日灌胃1次，連續(xù)治療一個(gè)月。

2.3 標(biāo)本的采集與處置

2.3.1 標(biāo)本的采集 造模及給藥結(jié)束后，采用10%水合氯醛，以300mg/Kg用量腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠。麻醉后，開胸暴露心肺，分離氣管，找出左右肺門（靠近心臟處）并鈍性分離，用線結(jié)扎左肺門，直剪在支氣管開一小口，插入灌胃針并用線結(jié)扎固定左肺后，用生理鹽水于右肺行支氣管肺泡灌洗2ml×3次。肺泡灌洗后提起支氣管，取出心臟及肺，切取新鮮肺部組織。

2.3.2 標(biāo)本處置 BALF標(biāo)本：收集灌洗液分3管備用，1 ml制成細(xì)胞涂片行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；余下采用ELISA法測(cè)定BALF中IL-8、TNF-α濃度。 肺組織標(biāo)本：左上肺放入試管內(nèi)先存放在液氮罐中，后放入-80℃冰箱中凍存待檢RT-PCR。

2.4 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定 試驗(yàn)中肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)有核細(xì)胞，分別計(jì)算巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的比例。

2.5 ELISA法測(cè)定BALF中IL-8和TNF-α濃度 參考試劑盒操作流程，進(jìn)行ELISA法BALF中IL-8、TNF-α濃度的測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)肺組織中IL-8、TNF-α mRNA的表達(dá) 采用Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用DreamTaqTM Green PCR Master Mix （2X）試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為： 95 ℃ 預(yù)變性4 min，94℃變性30 s， 56 ℃等退火40 s， 72 ℃延伸40 s， 35次循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行光密度掃描，以甘油醛-3磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，各基因的擴(kuò)增條帶的光密度值與各自內(nèi)參的光密度值之比作為衡量參數(shù)，用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity one 進(jìn)行觀察分析。具體的退火溫度及引物序列見表1。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法分析，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的行為學(xué)變化 在造模過程中，模型組大鼠精神狀態(tài)不佳、活動(dòng)遲緩、少動(dòng)，皮毛暗淡無光澤，可見毛發(fā)脫落，進(jìn)食量減少，體重增加遲緩，同時(shí)出現(xiàn)咳嗽、氣喘、氣急和鼻部分泌物流出等呼吸系統(tǒng)癥狀，重者可聞及哮鳴音。經(jīng)鼠曲草醇提物治療后，大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，未見明顯毛發(fā)脫落，進(jìn)食增加，偶見咳嗽、少見喘鳴和鼻腔分泌物流出。

3.2 鼠曲草醇提物對(duì)大鼠BALF炎癥細(xì)胞的影響 與正常組比較，模型組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比顯著升高（P<0.05），經(jīng)鼠曲草醇提物干預(yù)后，與模型組比較，鼠曲草醇提物組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比顯著降低（P<0.05），而巨噬細(xì)胞無顯著性差異。同時(shí)正常組、模型組和鼠曲草醇提物組三組的中性粒細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.3 鼠曲草醇提物對(duì)大鼠BALF中細(xì)胞因子IL-8和TNF-α含量的影響 與正常組比較，模型組BALF中TNF-α、IL-8含量均升高（P<0.05）；與模型組比較，鼠曲草醇提物組BALF中TNF-α、IL-8的含量明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

3.4 鼠曲草醇提物對(duì)大鼠肺組織中IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果見圖1，與正常組比較，模型組明顯上調(diào)肺組織中IL-8、TNF-α mRNA 的表達(dá)，經(jīng)鼠曲草醇提物干預(yù)后，與模型組比較，鼠曲草醇提物組明顯下調(diào)IL-8、TNF-α mRNA的表達(dá)。

4 討論

4.1 COPD的發(fā)生和發(fā)展中，氣道炎癥為其基本病理改變。在其早期，COPD肺泡灌洗液中呈現(xiàn)出白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加，以及巨噬細(xì)胞增多和活化。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分比顯著升高（P<0.05），經(jīng)鼠曲草醇提物干預(yù)后，鼠曲草醇提物組大鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比顯著降低，提示鼠曲草有改善COPD氣道炎癥的作用。同時(shí)炎癥細(xì)胞的增多可分泌、釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，介導(dǎo)和加重氣道炎癥，IL-8、TNF-α作為COPD發(fā)病過程中的主要細(xì)胞因子[4-5]，在COPD發(fā)病中有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中模型組BALF中TNF-α、IL-8含量均升高（P<0.05），經(jīng)鼠曲草醇提物干預(yù)后，鼠曲草醇提物組BALF中TNF-α、IL-8的含量明顯降低，同時(shí)鼠曲草醇提物組大鼠肺組織中IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)顯著降低，說明鼠曲草可降低炎癥細(xì)胞因子的水平，也提示鼠曲草有改善COPD氣道炎癥的作用。

4.2 我國(guó)鼠曲草資源豐富，近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，其在藥品和食品方面均具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。鼠曲草用于呼吸道疾病的治療已有文獻(xiàn)報(bào)道，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用靶點(diǎn)尚不明確，有文獻(xiàn)報(bào)道其黃酮類可能是其活性成分[6]。本文開展了鼠曲草醇提物改善COPD大鼠氣道炎癥的實(shí)驗(yàn)研究，為綜合開發(fā)利用鼠曲草資源提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2015.08.04）