右美托咪定對先心病患兒體外循環(huán)術后急性腎損傷的影響

尹彩星，劉 展，司海超，張新科，秦洪猛，杜守峰，李東峰，古婷婷，馮 丹，張蓉蓉，司小萌*

(1 南陽市中心醫(yī)院，南陽 473000；2 三亞市中醫(yī)院，三亞 572000)

先心病患兒體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)術后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)發(fā)病率達10% ～45%[1]，主要與CPB誘發(fā)的全身炎性反應、腎小管細胞凋亡等有關[2-4]。右美托咪定是一種α2腎上腺素能受體激動劑，可降低患者CPB術后AKI的發(fā)病風險[5-7]，但具體機制尚不明確。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)家族中部分成員可通過多種途徑介導機體的炎性反應。羅琳等[8]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)和Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)的表達，從而減輕體外循環(huán)術后的炎性反應。相關研究也證實[9-10]，右美托咪定可降低患者PBMC中TLR2和TLR4的表達水平。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，TLR3及其下游信號通路中的炎癥介質(zhì)參與了AKI的發(fā)病。鑒于目前關于右美托咪定和TLR3的相關性研究報道較少，本研究探討了右美托咪定對先心病患兒CPB術后的腎臟保護作用，以期為臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月～2019年6月于本院行CPB手術的先心病患兒168例作為研究對象，采用隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組84例。其中，男性患兒78例，女性患兒90例；年齡2～6歲，平均年齡(4.52±0.62)歲；先天性房間隔缺損40例，室間隔缺損128例。兩組患兒一般資料比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。所有患兒監(jiān)護人均知情同意并簽署知情同意協(xié)議書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(倫理批件號：YXLL2017-0311)。

表1 兩組患兒一般資料比較

(續(xù)表)

納入標準：① 兒童先心病診斷明確，符合《兒童常見先天性心臟病介入治療專家共識》標準[12]，在本院擇期行房間隔缺損或室間隔缺損修補，麻醉學ASA分級為Ⅰ～Ⅱ級，且所有患兒均在體外循環(huán)下完成心臟根治手術。② 臨床資料完整者。

排除標準：① 紫紺型先天性心臟病患者。② 術前肝腎功能異常、左室射血分數(shù)低于40%、右心衰竭、心律失常者。③ 術中開放升主動脈后心臟不能自動復跳、有嚴重心律失常者。④ 存在急性感染性疾病、自身免疫性疾病、貧血者。

1.2 治療方法

所有患兒均行脈搏血氧飽和度、心率及袖帶血壓監(jiān)測。有文獻報道[13]，右美托咪定腎臟保護作用推薦劑量為0.2～0.7 μg/(kg·h)。參考前期資料，本研究右美托咪定劑量選擇0.5 μg/(kg·h)。常規(guī)麻醉誘導前15 min，觀察組患兒給予靜脈注射鹽酸右美托咪定注射液[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20090248，規(guī)格2 ml∶200 g(按右美托咪定計)]負荷劑量1 μg/(kg·h)，隨后以0.5 μg/(kg·h)速度持續(xù)泵入至術后12 h；對照組僅給予靜脈泵入生理鹽水至術后12 h。麻醉誘導：靜脈注射咪達唑侖注射液(江蘇九旭藥業(yè)有限公司，國藥準字H20153019,規(guī)格3 ml∶15 mg)0.1～0.2 mg/kg；羅庫溴銨注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H20093186，規(guī)格5 ml∶50 mg)0.6 mg/kg；枸櫞酸舒芬太尼注射液(國藥集團工業(yè)有限公司廊坊分公司，國藥準字H20203713，規(guī)格按C22H30N2O2S計2 ml∶100 ug)1～2 μg/kg；丙泊酚乳狀注射液(廣東嘉博制藥有限公司，國藥準字H20133360,規(guī)格50 ml∶500 mg)2 mg/kg。麻醉誘導后在可視喉鏡下行氣管內(nèi)插管機械通氣，維持潮氣量為8～10 ml/kg，頻率20～30次/min，維持呼氣末CO2分壓30～35 mmHg?；純簶飫用}和右頸內(nèi)靜脈(超聲引導下)穿刺置管，持續(xù)泵入復方電解質(zhì)[2～4 ml/(kg·h)]，采用舒芬太尼1～2 μg/(kg·h)及羅庫溴銨1 mg/(kg·h)進行麻醉維持，體外循環(huán)開始前吸入七氟烷(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20040771)濃度1.5%～3%、空氣1 L/min和氧氣1 L/min。兩組術中操作：低分子量肝素鈉注射液(杭州九源基因工程有限公司，國藥準字H19990035，規(guī)格0.3 ml∶3000 IU)400 IU/kg靜脈推注，當穩(wěn)定的激活全血凝固時間 >480 s 后建立CPB，預充液為高滲羥乙基淀粉200/0.5氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司，國藥準字H20173260,規(guī)格250 ml∶羥乙基淀粉200/0.5 15 g與氯化鈉18 g)20 ml/kg滴注和乳酸林格注射液(上海長征富民金山制藥有限公司，國藥準字H31020947，規(guī)格500 ml)10 ml/kg滴注。轉(zhuǎn)流中注意維持血液中度稀釋紅細胞壓積0.2～0.3，術中維持食管溫度26 ℃～28 ℃，灌注流量100～150 ml/(kg·min)恒流灌注，灌注壓維持在50～80 mmHg。心肌保護采用組氨酸色氨酸-酮戊二酸鹽液(20～40 ml/kg)，主動脈根部灌注。轉(zhuǎn)流中根據(jù)血氣分析結果調(diào)節(jié)電解質(zhì)，恢復循環(huán)。開放升主動脈時，常規(guī)輸注鹽酸多巴胺注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H44022388，規(guī)格2 ml∶20 mg)0.5～5 μg/(kg·min)，必要時加用去氧腎上腺素0.1～10 μg/(kg·min)、多巴酚丁胺2.5～10 μg/(kg·min)等血管活性藥物。轉(zhuǎn)流停止后，靜脈注射硫酸魚精蛋白注射液(悅康藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字H11020246，規(guī)格5 ml∶50 mg)中和肝素，魚精蛋白與肝素之比為1∶1.2。所有患兒手術均由本院胸心外科同一治療組的醫(yī)生完成。

1.3 觀察指標

記錄兩組患兒圍手術期的整體情況，主要包括麻醉誘導至切皮時間、主動脈阻斷時間、手術時間、麻醉時間、血流動力學指標[如心率、平均動脈壓(mean arterial pressure，MVP)、中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)]等；在術前(T0)、麻醉誘導后30 min(T1)、術后24 h(T2)、術后48 h(T3)及術后 72 h(T4)分別抽取外周靜脈血3 ml于抗凝管中，用JIDI-20D離心機(廣州吉迪儀器有限公司)8000 r/min 離心5 min，收集上層血清后置于-80 ℃冰箱中保存。血清肌酐水平由本院檢驗科采用BK-400自動生化儀(Biobase公司)進行檢測。AKI參考診斷標準[14]：腎功能48 h內(nèi)急劇下降，血清肌酐水平上升≥26.5 μmol/L或≥基礎水平的1.5倍，或者尿量減少<0.5 ml/(kg·h)，時間超過6 h。

1.3.1流式細胞儀檢測TLR3+細胞百分比

取上述相同時間點患兒外周靜脈血2 ml于肝素鈉抗凝管中，采用Ficoll淋巴細胞分離液分離PBMC。全血中PBMC具體分離步驟為：2 ml外周靜脈血加入抗凝管中，室溫下加入等體積PBS吹打混勻，繼續(xù)加到含有5 ml Ficoll淋巴細胞分離液的離心管中，8000 r/min離心30 min后，采用移液管插入離心管中的云霧層，輕輕吸出全部云霧層于新的離心管中，再次加入2倍體積的PBS洗滌2次，5000 r/min離心10 min并棄上清，獲得的PBMC細胞濃度調(diào)整至106個/ml，取500 μl并加入破膜劑孵育30 min，再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的TLR3單抗，置于4 ℃冰箱中繼續(xù)孵育30 min，PBS洗滌1次，重懸細胞，用Accuri C6流式細胞儀(BD公司)上機檢測樣本中TLR3+細胞百分比。

1.3.2ELISA法檢測血清NF-κB、IL-1β和TNF-α表達水平

采用ELISA法檢測血清炎癥因子NF-κB(美國R&D公司)、IL-1β和TNF-α(上海碧云天生物技術有限公司)，實驗操作步驟參考試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患兒圍手術期血流動力學比較

兩組患兒在T0～T35個時間點的心率、MAP和CVP比較無統(tǒng)計學差異。見表2。

表2 兩組患兒圍手術期心率、MVP、CVP比較

2.2 兩組患兒不同時間點外周靜脈血PBMC中TLR3+細胞百分比

在T0和T1時間點，兩組患兒外周血PBMC中TLR3+細胞百分比無統(tǒng)計學差異；在T2、T3和T4時間點，觀察組患兒PBMC中TLR3+細胞百分比低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患兒PBMC中TLR3+細胞百分比

2.3 兩組患兒不同時間點肌酐、NF-κB、IL-1β、TNF-α表達水平比較

T3和T4時間點，觀察組患兒血清肌酐水平低于對照組(P<0.05)；T2、T3和T4時間點，觀察組患兒血清NF-κB水平低于對照組(P<0.05)；T3和T4時間點觀察組患兒血清IL-1β和TNF-α表達水平低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患兒肌酐、NF-κB、IL-1β和TNF-α表達水平比較

2.4 兩組患兒術后AKI發(fā)生率比較

術后48 h對兩組患兒AKI發(fā)生率進行評估，觀察組患兒AKI發(fā)生率(5.95%)低于對照組(19.05%)，具有統(tǒng)計學差異(χ2=6.585，P=0.010)。

3 討論

國內(nèi)外研究證實，先心病患兒CPB術后AKI發(fā)生率在10% ～45%[1,15]，其中死亡患兒比例達15.25%[15]，且術后合并AKI嚴重影響了患兒的臨床預后。因此，盡快明確AKI發(fā)病機制尤為重要。盡管有文獻報道[15-16]患兒CPB術后發(fā)生AKI可能與多種誘因(如血糖水平、年齡、體外循環(huán)時間、主動脈阻斷時間等)有關，但術后全身炎性反應在AKI的發(fā)病機制中扮演了重要作用[2-3]。Abdallah等[17]發(fā)現(xiàn)白介素18(interleukin-18，IL-18)水平較高是術后AKI發(fā)病的重要預測因子，且與致死率相關；Jacob等[18]開展的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，采用高劑量地塞米松抗炎預處理后可顯著降低AKI的發(fā)生風險，同時心臟手術中應用白細胞過濾器能緩解患者術后腎功能的惡化[19]。上述結果均提示炎性反應在AKI發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。目前，多數(shù)研究僅探討右美托咪定對TLR2和TLR4表達水平的影響[8-10]，然而其與TLR3的相關性研究報道較少。另一方面，TLR3/NF-κB信號通路在AKI發(fā)病機制中作用顯著[11]，且右美托咪定具有腎臟保護作用。因此，本研究系統(tǒng)分析了右美托咪定干預對CPB患兒PBMC中TLR3表達及其下游信號NF-κB、TNF-α及IL-1β水平的影響。

本研究結果表明，右美托咪定可降低CPB術后患兒PBMC中TLR3+細胞百分比，TLR3與含TIR結構域的銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)結合后，通過腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)N端的結合域誘導NF-κB的激活[20]，而NF-κB可通過多種途徑介導機體的炎性反應，其中最為常見的是其下游的炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達[21]。李霽等[22]發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒誘導的AKI大鼠腎組織中，NF-κB和TNF-α蛋白表達水平升高；丁仁彧等[23]也證實，脂多糖誘導的AKI小鼠模型的血清和腎臟組織中IL-1β和TNF-α表達水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患兒在術后 24 h 開始，血清NF-κB水平低于對照組，但血清 IL-1β 和TNF-α表達水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異；在術后48和72 h時間點，血清IL-1β和TNF-α表達水平低于對照組。另一方面，F(xiàn)as相關死亡結構域在NF-κB的介導下進一步活化Caspase信號通路，從而誘導細胞的大量凋亡。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的主要蛋白[24]。國內(nèi)外研究[23，25]均證實，AKI動物模型的腎臟組織中Caspase-3蛋白和Caspase-3 mRNA表達水平較高；Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可降低肺組織中Caspase-3蛋白的表達，且呈現(xiàn)劑量依賴性。因此，本研究提出右美托咪定預處理對CPB患兒術后腎損傷的保護作用可能與降低Caspase-3蛋白表達水平有關。

術后48 h觀察組患兒AKI發(fā)生率低于對照組，說明右美托咪定對CPB患兒腎臟具有保護作用；檢測肌酐水平發(fā)現(xiàn)，術后24 h兩組肌酐水平相比無統(tǒng)計學差異，而在48 h觀察組患兒肌酐水平低于對照組，這可能是腎臟受損后血清肌酐水平變化不敏感所致。因此，其他研究也提出采用其他分子標志物[如血或尿中IL-18、尿液中腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)及中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)]等預測AKI的發(fā)生風險[27]。

綜上所述，本研究參考前期文獻報道將右美托咪定干預劑量設置為0.5 μg/(kg·h)，發(fā)現(xiàn)其對CPB術后腎臟具有保護作用，推測其主要與抑制TLR3/NF-κB信號通路及其下游的炎癥因子有關。本研究有一定局限性，右美托咪定對CPB術后腎臟保護作用與其他濃度的關系還需進一步研究。此外，本研究未對患兒PBMC和腎臟組織中的相關蛋白(如NF-κB、IL-1β、TNF-α等)進行檢測；右美托咪定對CPB術后腎臟保護作用的其他機制也將是我們下一步探討的方向。