植物抗病毒機(jī)制與轉(zhuǎn)基因番木瓜

肖湘君 肖義軍

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

1 植物病害與植物對(duì)病毒的交叉保護(hù)現(xiàn)象

植物病害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，而其中部分病害則由植物病毒引起。例如，大家熟悉的煙草花葉病毒可侵染煙草等茄科植物，引起葉片厚薄不勻，顏色黃綠相間，呈花葉狀；發(fā)病早期的植株節(jié)間縮短，嚴(yán)重矮化，生長(zhǎng)緩慢。水稻矮化病毒曾于1973—1977年間在菲律賓流行，導(dǎo)致部分地區(qū)水稻顆粒無收。

早在1928年就有人觀察到，接種了煙草環(huán)斑病毒弱毒株的煙草，雖然接種葉出現(xiàn)壞死斑，但植株整體獲得了對(duì)同種及相近種病毒的抗性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，其他植物也大多存在類似現(xiàn)象，人們把此種現(xiàn)象稱為交叉保護(hù)。這種現(xiàn)象與動(dòng)物接種疫苗后產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性很相似，但植物并不具備動(dòng)物那樣的免疫系統(tǒng)，也從未有人發(fā)現(xiàn)在植物體內(nèi)有針對(duì)病毒的抗體存在，因此兩者的機(jī)制并不一樣。人們提出過好幾種假說試圖解釋這種現(xiàn)象，但都無法得到證實(shí)。直到1990年，美國(guó)科學(xué)家Jorgensen等在研究矮牽?；ㄉ兓瘯r(shí)發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象，植物的交叉保護(hù)機(jī)制才得以最終闡明。

2 植物的抗病毒機(jī)制

植物在與病毒的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中進(jìn)化出了多種多樣的抗病毒機(jī)制，植物表面具有的角質(zhì)層、蠟質(zhì)層和細(xì)胞壁等物理屏障足以阻止大部分的病毒侵染，一些植物還通過突變使自身喪失病毒復(fù)制或運(yùn)動(dòng)所需的基因產(chǎn)物而導(dǎo)致病毒失去侵染力。不過，目前最受關(guān)注的植物抗病毒機(jī)制是RNA沉默和R基因介導(dǎo)的病毒抗性。

2.1 植物的RNA介導(dǎo)的病毒基因沉默機(jī)制 Jorgensen等為了得到花色更深的矮牽牛，將與花色形成密切相關(guān)的查耳酮合酶基因(CHS)導(dǎo)入到開紫花的野生型矮牽牛中，卻意外地發(fā)現(xiàn)約有1/4的轉(zhuǎn)基因后代開白花或紫白相間的花，其CHS基因的表達(dá)比野生型顯著下調(diào)，他們當(dāng)時(shí)推測(cè)可能是外源導(dǎo)入的CHS基因抑制了植物內(nèi)源CHS基因的表達(dá)，這就是所謂的RNA沉默現(xiàn)象，即小RNA(sRNA)通過誘導(dǎo)與其互補(bǔ)的mRNA或病毒RNA的降解或翻譯抑制、DNA或組蛋白修飾等過程，抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，使得靶基因沉默[2]。病毒RNA沉默現(xiàn)象是目前已闡明的植物抗病毒的重要機(jī)制之一。RNA沉默介導(dǎo)的植物抗病毒反應(yīng)主要包括4個(gè)步驟： ①植物病毒(大多是RNA病毒)侵染入細(xì)胞后通過多種方式生成雙鏈RNA(dsRNA)；②dsRNA經(jīng)Dicer-樣蛋白(Dicer是動(dòng)物和真菌細(xì)胞的一種dsRNA特異性核糖核酸酶的內(nèi)切酶，屬于RNaseⅢ家族)切割加工成為18～25個(gè)bp的病毒sRNA；③成熟的病毒sRNA與argonaute蛋白(是RNA基因沉默途徑中的核心元件，屬于一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)；④在RISC中，病毒sRNA指導(dǎo)與其互補(bǔ)的病毒基因組的切割，從而抵抗病毒的入侵[3]，而這些沉默信號(hào)在受感染的細(xì)胞中產(chǎn)生后可通過胞間連絲擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞，再沿著篩管組織擴(kuò)散到整個(gè)植株細(xì)胞中，激發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)性的抗病毒效應(yīng)，從而使整個(gè)植株產(chǎn)生對(duì)同類病毒的抗性[4]。

值得注意的是，在長(zhǎng)期競(jìng)爭(zhēng)過程中，病毒也進(jìn)化出了抵抗RNA沉默的機(jī)制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在植物存在P1/HC-Pro、 P38、 2b、 βC1等RNA沉默抑制子，這些沉默抑制子可通過抑制包括sRNA生成在內(nèi)的多個(gè)環(huán)節(jié)，來抑制宿主細(xì)胞中的RNA沉默系統(tǒng)，使病毒逃脫宿主的防御反應(yīng)[5]。

2.2R基因介導(dǎo)的植物抗病毒機(jī)制 除了RNA沉默介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)外，R基因(resistance genes)介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制也是目前科學(xué)家最為關(guān)注的植物抗病毒機(jī)制。R基因可介導(dǎo)對(duì)包括病毒在內(nèi)的多種病原體的抗性。當(dāng)植物受到病原體侵染時(shí)，R基因直接或間接識(shí)別特定病原體的無毒基因，激活植物的防御反應(yīng)，引發(fā)侵染點(diǎn)周圍細(xì)胞的程序性死亡，導(dǎo)致周邊細(xì)胞活性氧爆發(fā)、細(xì)胞壁加厚，使病毒被限制在損害的局部，不能擴(kuò)散至周圍健康組織。同時(shí)整株植物還通過一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程誘導(dǎo)出現(xiàn)非專一性抗多種病原體的系統(tǒng)性的獲得性抗性(system acquired resistance)[6]。

3 抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜

3.1 RNA沉默是轉(zhuǎn)基因植物抗病毒的分子機(jī)制 植物病毒給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極大困擾，對(duì)于植物病毒性疾病的防治一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上關(guān)注的重要問題。由于化學(xué)藥物無法抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制增殖，植物病毒性疾病難以用藥物防治。傳統(tǒng)上，篩選和培育抗性品種是防治植物病蟲害的有效方法之一，因?yàn)橐恍┳魑锏哪承┢贩N或其野生種可能具有抗蟲抗病基因，將普通栽培品種與它們進(jìn)行雜交，就有可能獲得抗性基因。然而并不是對(duì)于每一種病害，都能在自然界找到抗性品種作為育種材料。即便能找到抗性材料，要育成一個(gè)抗性品種也需要進(jìn)行大量的篩選等育種工作，非常耗時(shí)耗力。特別是對(duì)于病毒來說，由于其變異速度很快，容易通過變異產(chǎn)生對(duì)抗宿主抗病毒基因的新毒株，使育種成果前功盡棄。相對(duì)而言，通過轉(zhuǎn)基因的辦法來培育抗病毒品種是比較有效的方法。由于病毒RNA沉默現(xiàn)象的存在，理論上只要給植物轉(zhuǎn)入一個(gè)病毒的基因或其部分片段，植物就會(huì)產(chǎn)生對(duì)該病毒甚至同類其他病毒的抗性，通過選育就可以獲得具有商業(yè)價(jià)值的抗病毒品種。轉(zhuǎn)基因番木瓜(CaricapapayaL.)就是一個(gè)很成功的例子。

3.2 番木瓜環(huán)斑病毒是番木瓜生產(chǎn)的主要威脅 市場(chǎng)上作為水果銷售的木瓜其實(shí)是番木瓜，原產(chǎn)地在南美，目前在我國(guó)南方地區(qū)普遍種植，主產(chǎn)地在廣東、廣西和海南。番木瓜是目前唯一在中國(guó)大陸種植的可食用轉(zhuǎn)基因作物(目前在中國(guó)大陸種植的轉(zhuǎn)基因作物共有3種，另2種是棉花和白楊)。番木瓜作為一種廣受人們喜愛的水果，其生產(chǎn)卻一直受到番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)的嚴(yán)重威脅。PRSV是單鏈正鏈RNA病毒，含有10 326個(gè)核苷酸，主要經(jīng)蚜蟲傳播，能侵染多種葫蘆科植物，分布于全世界，成為制約番木瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要的因素，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致番木瓜減產(chǎn)八九成。PRSV的綜合防治措施包括采用無毒種子、隔離區(qū)或種植地盡量遠(yuǎn)離感染了病毒的地塊、遠(yuǎn)離其他葫蘆科植物、系統(tǒng)地除草以減少蟲口、每?jī)芍芤淮伟纬≈暌约跋麥缪料x、將番木瓜種植在隔離室內(nèi)以使帶毒蚜蟲不能到番木瓜上取食等。這些方法成本高、效果也不好。培育PRSV抗性品種是防治番木瓜環(huán)斑病最根本的方法，但番木瓜栽培品種中缺乏PRSV抗性資源，由于生殖隔離，野生番木瓜中的PRSV抗性基因又很難通過常規(guī)的雜交方法轉(zhuǎn)移到番木瓜栽培品種中。

3.3 抗番木瓜環(huán)斑病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜品種的制備 要想利用交叉保護(hù)作為防治PRSV的重要措施之一，就必須通過接種弱毒株，使番木瓜獲得對(duì)強(qiáng)毒株的抗性，從而獲得保護(hù)。但對(duì)于大規(guī)模種植來說，要在短時(shí)間內(nèi)逐株接種是一個(gè)難以完成的任務(wù)。采用轉(zhuǎn)基因的方法培育抗毒品種顯然是一個(gè)最現(xiàn)實(shí)的辦法。由于PRSV曾對(duì)夏威夷島上的番木瓜產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性打擊，美國(guó)夏威夷大學(xué)和康奈爾大學(xué)于1986年開始致力于抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜的研究。由于最初認(rèn)為這種抗性是病毒外殼蛋白誘發(fā)的，他們首先就將PRSV毒株HA5-1的外殼蛋白(coat protein， CP)基因通過基因槍法導(dǎo)入番木瓜愈傷組織內(nèi)，于1990年獲得了世界上首例轉(zhuǎn)PRSV-CP基因的番木瓜，并在1998年4月獲得了商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因木瓜的許可(商品名“SunUp”和“Rainbow”)。抗PRSV的轉(zhuǎn)基因番木瓜的培育成功，拯救了夏威夷的番木瓜產(chǎn)業(yè)[7]。

但美國(guó)開發(fā)出的“SunUp”和“Rainbow”兩個(gè)優(yōu)良抗PRSV番木瓜品種，其主要針對(duì)的是夏威夷地區(qū)的HA病毒株系，對(duì)我國(guó)華南地區(qū)4個(gè)主要番木瓜環(huán)斑病毒株系Ys(優(yōu)勢(shì)株系)、Vb、Sm和Lc，以及我國(guó)臺(tái)灣YK株系和泰國(guó)等亞洲國(guó)家的番木瓜環(huán)斑病毒株系不具有抗性。因此，不同國(guó)家開始選用當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)病毒株系的基因進(jìn)行番木瓜轉(zhuǎn)基因研究，以期獲得具有良好當(dāng)?shù)剡m應(yīng)性的轉(zhuǎn)基因品系。此外，由于PRSV是經(jīng)由蚜蟲傳播的，而蚜蟲可傳播多種植物病毒，出于對(duì)潛在風(fēng)險(xiǎn)的考慮，人們也擔(dān)心導(dǎo)入植物的PRSV-CP基因的表達(dá)產(chǎn)物可能與其他病毒基因組裝導(dǎo)致新病毒的產(chǎn)生。

RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，使科學(xué)家認(rèn)識(shí)到這種由病毒誘導(dǎo)的抗性主要是通過RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默實(shí)現(xiàn)的，而并不是由病毒的外殼蛋白誘導(dǎo)的。因此，理論上只要將PRSV的基因或部分片段導(dǎo)入到番木瓜細(xì)胞中，這些基因或片段在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的mRNA進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中后，將與入侵的PRSV核酸進(jìn)行特異性的結(jié)合并使其降解，從而獲得保護(hù)。

于是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將我國(guó)華南地區(qū)PRSV的優(yōu)勢(shì)株系Ys的復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)入番木瓜植株，培育成功了我國(guó)首例獲得商業(yè)化生產(chǎn)許可(2006年)的轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”，目前已在華南地區(qū)廣泛種植，該品種抗性廣，對(duì)我們?nèi)A南地區(qū)流行的各種番木瓜環(huán)斑病毒毒株都具有很好的抗性，深受瓜農(nóng)喜愛，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益[8]。

從食品安全性的角度來看，轉(zhuǎn)基因番木瓜與普通番木瓜沒有任何不同。大量觀察表明，轉(zhuǎn)基因番木瓜的病毒蛋白對(duì)人體不存在有毒或過敏問題。實(shí)際上，在人們的日常生活中，經(jīng)常食用感染了病毒的水果和蔬菜，只是沒有意識(shí)到而已，但并沒有出現(xiàn)由植物病毒成分引起的不良反應(yīng)。自植物病毒發(fā)現(xiàn)以來，至今還沒有發(fā)現(xiàn)植物病毒可以侵染人類的案例。我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜的食用安全性、過敏原性也進(jìn)行了長(zhǎng)期跟蹤研究，沒有發(fā)現(xiàn)任何安全問題。事實(shí)上，由于轉(zhuǎn)基因抗病毒的機(jī)制是利用了RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，與自然界中感染病毒的植物相比，轉(zhuǎn)基因抗性植物幾乎不產(chǎn)生病毒蛋白或者可能產(chǎn)生極低濃度的病毒蛋白。而且，由于轉(zhuǎn)基因番木瓜的抗性，還可以大大減少殺蟲劑的使用，減輕農(nóng)藥殘留的問題。