海南竹柏扁枝病病原植原體的分子檢測(cè)鑒定

楊靜宇等

摘 要 提取采自海南萬(wàn)寧熱帶植物園中表現(xiàn)典型扁枝癥狀的竹柏植株總DNA，利用植原體16S rRNA基因通用引物對(duì)P1/P7和R16F2n/R16R2進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：擴(kuò)增到大小約1.2 kb的植原體特異片段，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列比對(duì)分析，結(jié)果確定為植原體感染。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，該植原體（GenBank登錄號(hào)：KP027298）為australasiae植原體候選種相關(guān)株系，與australasiae植原體候選種（GenBank 登錄號(hào)：Y10097）的同源性為99.4%。進(jìn)一步虛擬RFLP分析，結(jié)果表明該植原體屬于花生叢枝植原體組（16Sr II）的一個(gè)新亞組，與其相似性最高的是16Sr II-A亞組（相似系數(shù)為0.97）。為指導(dǎo)竹柏扁枝病的防治奠定理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 竹柏；扁枝病；植原體；分子鑒定；16S rRNA

中圖分類(lèi)號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In this paper， universal primers of P1/P7 and R16F2n/R16R2 for phytoplasmal 16S rRNA gene were used to detect phytoplasma by nested PCR respectively. The 1.2 kb DNA fragments were amplified from the total DNA of Podocarpus nagi（Thunb.）Zoll. et Mor ex Zoll with fasciation disease symptoms， which were collected from the Tropical Botanical Garden， Wanning， Hainan. Sequence analysis determined that the P. nagi with fasciation disease was caused by a phytoplasma（GenBank accession： KP027298）， which shared 99.4% similarity of the ‘Candidatus Phytoplasma australasiaereference strain（GenBank accession： Y10097）. Furthermore， virtual RFLP analysis showed that the phytoplasma belonged to to a new subgroup within the peanut witches-broom（16Sr II）group， the most similar was the reference pattern of the 16Sr group II， subgroup A（GenBank accession： L33765）， with a similarity coefficient of 0.97. The study is important for effective prevention of the disease.

Key words Podocarpus nagi；Fasciation；Phytoplasma；Molecular identification；16S rRNA

植原體是一種無(wú)細(xì)胞壁的植物病原細(xì)菌，被歸類(lèi)于細(xì)菌界（Bacteria）軟壁菌門(mén)（Tenericutes）柔膜菌綱（Mollicutes）非固醇菌原體目（Acholeplasmatales）非固醇菌原體科（Acholeplasmataceae）植原體暫定屬[Candidatus（Ca.）genus Phytoplasma][1]。植原體中的G-C含量低，寄生于植物韌皮部篩管細(xì)胞中，通過(guò)破環(huán)植物體內(nèi)激素的平衡，削弱氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制光合作用，加速衰老，誘導(dǎo)病害癥狀產(chǎn)生[2-5]，感病植株的典型癥狀有黃化、叢枝、簇生、花變?nèi)~、矮化、小葉等[6]，主要通過(guò)葉蟬、飛虱等昆蟲(chóng)媒介進(jìn)行傳播[6-7]。植原體是許多植物病害的重要病原，迄今為止，全世界已報(bào)道的植原體病害超過(guò)1 000多種，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于植原體無(wú)法分離培養(yǎng)，所以，不能通過(guò)常規(guī)的微生物分類(lèi)方法進(jìn)行分類(lèi)鑒定，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，利用PCR方法擴(kuò)增植原體的保守序列16S rRNA，并通過(guò)序列比對(duì)和RFLP分析能有效的對(duì)植原體進(jìn)行鑒定和分類(lèi)[8]。

RFLP分析是通過(guò)一個(gè)基于16S rRNA基因進(jìn)行植原體快速分類(lèi)鑒定的在線工具-iPhyClassifier在線進(jìn)行序列同源性分析。模擬實(shí)驗(yàn)室限制性內(nèi)切酶消化和凝膠電泳并生成虛擬限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖像文件；能實(shí)現(xiàn)IRPCM植原體/螺原體工作小組建立的植原體候選種分類(lèi)方法[8]和Wei等[9]提出的16Sr組和亞組的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)計(jì)算整個(gè)序列的同源性分?jǐn)?shù)和RFLP模型的相似系數(shù)，立即對(duì)植原體候選種的分配和植原體16Sr組分類(lèi)地位的假定給出建議。iPhyClassifier將序列同源性分?jǐn)?shù)97.5%作為劃分植原體候選種的臨界值，RFLP模型相似系數(shù)0.85、0.97分別作為劃分植原體16Sr 組和亞組的臨界值[9]。當(dāng)提交的16S rRNA基因序列同源性分?jǐn)?shù)小于97.5%時(shí)，建議該植原體可代表一個(gè)新的植原體候選種；大于或等于97.5%時(shí)，建議為某一植原體候選種的相關(guān)株系。RFLP模型的相似系數(shù)小于或等于0.85時(shí)，建議該植原體可代表新的植原體16Sr組；相似系數(shù)大于0.85但小于或等于0.97時(shí)，建議該植原體可代表新的植原體16Sr亞組或已有16Sr亞組的不同株系或變種[10]。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的16S rRNA序列，RFLP分析可將植原體分為32個(gè)組，有效地提高了基于16S rRNA基因序列的植原體分類(lèi)系統(tǒng)[11]。

竹柏[Podocarpus nagi（Thunb.）Zoll. et Mor ex Zoll]為羅漢松科竹柏屬的一種常綠喬木，廣泛分布于浙江、福建、江西、湖南、廣東、廣西、臺(tái)灣、海南和四川等地。竹柏是中國(guó)南方優(yōu)良的多用途經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，由于其枝葉常綠、樹(shù)形美觀，可用于庭園綠化；其樹(shù)干紋理直、結(jié)構(gòu)細(xì)、易加工、耐久用，可用作建筑、家具、器具及工藝用材；其種仁含油率為50%～55%，經(jīng)加工后可作為優(yōu)質(zhì)食用油或工業(yè)用油[12]。近些年，在海南萬(wàn)寧熱帶植物園的竹柏樹(shù)上大量發(fā)生一種病害，該病害表現(xiàn)為莖端分生組織擴(kuò)大，側(cè)向分支不能獨(dú)立于主枝生長(zhǎng)，長(zhǎng)出的枝條呈扁平的帶狀或雞冠狀，嚴(yán)重影響了竹柏的正常生長(zhǎng)。該種癥狀在仙人掌[13]、黃槐[14]、中華小苦荬[15]等植物上曾有報(bào)道，但在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于竹柏扁枝病病原的相關(guān)報(bào)道。

本研究以表現(xiàn)扁枝癥狀的竹柏植株為材料，提取植株總DNA后，利用PCR技術(shù)進(jìn)行16S rRNA基因片段的擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列比對(duì)分析，以確定是否為植原體感染；再通過(guò)進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析及RFLP分析，以明確該病原的分類(lèi)地位。

1 材料與方法

1.1 材料

表現(xiàn)典型扁枝癥狀的竹柏植株和無(wú)癥狀的健康竹柏植株均采自海南萬(wàn)寧熱帶植物園。DNA Ladder Maker 2000、克隆載體pMD18-Tsimple vector、感受態(tài)E. coli Competent Cell DH5a菌株購(gòu)自TaKaRa公司，2×Eco Taq Master Mix、瓊脂糖凝膠、DNA 回收試劑盒及質(zhì)粒回收試劑盒、氨芐青霉素和IPTG購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA的提取 分別取典型扁枝癥狀的竹柏植株和無(wú)癥狀的健康竹柏植株的幼莖韌皮部，使用 DNeasy plant mini kit（Qiagen Gmbh， Hilden， Germany）DNA提取試劑盒，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明分別提取植株的總DNA，提取的總DNA放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 利用植原體16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以植物總DNA為模板，參照Deng等[16]和Schneider等[17]報(bào)道的引物P1/P7先進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增（表1），其擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（溫度從64～56 ℃，每2個(gè)循環(huán)退火溫度降低2 ℃，再在54 ℃的退火溫度下進(jìn)行25個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸110 s；最后72 ℃延伸4 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍后做為模板，根據(jù)Gundersen等[18]報(bào)道的引物R16F2n/R16R2再進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增（表1），其擴(kuò)增條件為：最后退火溫度改為56 ℃，延伸時(shí)間改為70 s，其余條件與直接PCR擴(kuò)增相同。PCR體系均為25 μL，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察攝影并記錄圖片。以健康植株總DNA為陰性對(duì)照，無(wú)菌蒸餾水為空白對(duì)照。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序 利用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將目的產(chǎn)物連接到載體pMD18-T，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，取白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，利用菌落PCR反應(yīng)篩選陽(yáng)性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。為了盡量減少可能產(chǎn)生的測(cè)序誤差，每個(gè)樣品至少選擇3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和RFLP分析 先使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和裝配，再將序列提交到NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與GenBank中已有的序列進(jìn)行同源性比較分析，并利用鄰接法在MAGA5.0[19]中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。最后使用植原體在線分析軟件iPhyClassifier進(jìn)行虛擬的RFLP分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株的癥狀表現(xiàn)

由圖1可知，感病的竹柏植株表現(xiàn)為莖端分生組織擴(kuò)大，側(cè)向分枝不能獨(dú)立于主枝生長(zhǎng)，長(zhǎng)出的枝條呈扁平的帶狀或雞冠狀。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

表現(xiàn)典型扁枝癥狀的竹柏植株和健康的竹柏植株均利用引物對(duì)P1/P7、R16F2n/R16R2進(jìn)行巢式PCR，結(jié)果見(jiàn)圖2，感病的竹柏植株中擴(kuò)增出約1.2 kb的特異條帶，與目標(biāo)片段的大小相符，而作為陰性對(duì)照的健康植株和空白對(duì)照的無(wú)菌蒸餾水均未擴(kuò)增出條帶。表明表現(xiàn)典型扁枝癥狀的竹柏植株中存在植原體。

2.3 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將擴(kuò)增出的特異條帶進(jìn)行純化、克隆和測(cè)序。結(jié)果顯示，16S rRNA基因擴(kuò)增片段均含有1 248個(gè)核苷酸（GenBank 登錄號(hào)：KP027298），G+C含量為47.4%。在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)后，結(jié)果表明，該植原體是australasiae植原體候選種相關(guān)株系，與australasiae植原體候選種（GenBank No.：Y10097）的同源性最高，為99.4%。利用MEGA5中的鄰接法，將海南竹柏扁枝病的植原體與其他相關(guān)植原體代表株系進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，由圖3可知，竹柏扁枝病植原體與植原體 16S rⅡ組成員聚集在同一進(jìn)化分支上， 并與 16S rⅡ組A亞組的花生叢枝植原體（L33765）聚為一簇。

2.4 RFLP分析

使用植原體在線分析軟件iPhyClassifier對(duì)海南竹柏扁枝病植原體進(jìn)行虛擬RFLP分析，分析結(jié)果表明，該植原體16S rRNA基因片段的限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析模型不同于所有以前建立的16Sr組/亞組的參考模型。該植原體屬于花生叢枝植原體組（16Sr II）的一個(gè)新亞組，與其相似性最高的是16Sr II-A亞組（GenBank登錄號(hào)：L33765），相關(guān)系數(shù)是0.97。

3 討論與結(jié)論

竹柏扁枝病的發(fā)生使得竹柏枝條呈扁平帶狀或雞冠狀，影響了其木材的形狀和質(zhì)量，降低了竹柏木材的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但受植原體感染而形成的扁平帶狀或雞冠狀枝條具有一定的觀賞性，可通過(guò)利用植原體引起的獨(dú)特性狀使得竹柏更具觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前已有報(bào)道顯示植原體能成為形成植株理想經(jīng)濟(jì)性狀的重要誘導(dǎo)劑，如花卉產(chǎn)業(yè)中重要的觀賞盆栽植物一品紅[20]，植原體能誘導(dǎo)使其叢簇生長(zhǎng)無(wú)分支，更具觀賞價(jià)值，形成一品紅最理想和重要的經(jīng)濟(jì)性狀而被大量商業(yè)化種植。但人為嫁接植原體進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀的誘導(dǎo)可能帶來(lái)植原體的擴(kuò)散，有關(guān)工作尚需進(jìn)一步的研究。

本研究利用巢式PCR擴(kuò)增、序列分析、同源性比較等分子生物學(xué)方法對(duì)竹柏扁枝病植原體進(jìn)行了分子檢測(cè)鑒定，確定了海南竹柏扁枝病是由植原體引起的，且該植原體是australasiae植原體候選種的相關(guān)株系。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示該植原體與植原體16S rⅡ組成員聚集在同一進(jìn)化分支上，屬于花生叢枝植原體組（16Sr II）的一個(gè)新亞組，與16S rⅡ組A亞組（GenBank登錄號(hào)：L33765）的花生叢枝植原體聚為一簇，相似性最高。

近年來(lái)，南方地區(qū)報(bào)道較多的16S rⅡ-A組植原體侵染病害有花生叢枝病[21]、豬屎豆叢枝病[22]、臭矢菜叢枝病[23]等， 而在木本植物海南竹柏上發(fā)現(xiàn)16S rⅡ-A組植原體是首次報(bào)道。有研究報(bào)道顯示，花生叢枝病與豬屎豆、臭矢菜都有很近的親緣關(guān)系，16S rRNA其基因序列的相似性均大于99.8%，且發(fā)生花生叢枝病危害和流行的地方也發(fā)現(xiàn)過(guò)豬屎豆、臭矢菜等豆科植物叢枝病的發(fā)生，可能是16S rⅡ-A組植原體侵染了不同寄主， 或者存在密切的遺傳變異或系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[21]?；ㄉ鷧仓χ苍w16S rⅡ-A組中的臭矢豆叢枝植原體與竹柏扁枝病植原體的親緣關(guān)系也非常近，16S rRNA基因序列相似性達(dá)到99.2%，只有9個(gè)堿基存在差異。隨著植原體分類(lèi)發(fā)展的深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅依靠16S rRNA基因序列對(duì)植原體進(jìn)行分類(lèi)不能滿足亞組及株系的劃分，因此，仍需對(duì)海南竹柏扁枝植原體的tuf、secY、rp基因等核苷酸序列進(jìn)行分析研究，更進(jìn)一步的研究植原體亞組及株系之間的關(guān)系，以便為指導(dǎo)竹柏扁枝病的防治奠定更多理論依據(jù)。

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