崗梅實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

鄭夏生等

摘 要 為篩選適用于崗梅實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析18S rRNA（18S）、Actin（ACT）、α-tubulin（TUA）、β-tubulin（TUB）、Cyclophili（CYP）、Elongation factor 1-α（EF-1α）和Polyubiquitin（UBQ）共7個(gè)看家基因在崗梅的8個(gè)不同組織部位中的表達(dá)情況，并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper共3個(gè)軟件對(duì)每個(gè)看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。3個(gè)軟件的分析結(jié)果均表明：18S、ACT和TUA看家基因的穩(wěn)定性和相關(guān)性均較好，可在這3個(gè)看家基因中選擇1個(gè)或以18S-ACT、18S-TUA組合作為崗梅基因研究的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞 崗梅；qRT-PCR；內(nèi)參基因

中圖分類號(hào) R28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract This study aimed to select reference gene（s） for real time quantitative PCR（qRT-PCR）research in I. asprella. The expression levels of seven housekeeping genes （HKGs）， including 18S rRNA（18S）， Actin（ACT）， α-Tubulin （TUA）， β-Tubulin （TUB）， Cyclophili （CYP）， Elongation factor 1-α （EF 1α） and Polyubiquitin（UBQ）， in eight different tissues of I. asprella， were analyzed by qRT-PCR. Furthermore， their expression stabilities were evaluated by three software， including GeNorm， NormFinder and BestKeeper. Analysis data showed that 18S， ACT and TUA expressed stably and were related to each other in different tissues of I. asprella. 18S， ACT and TUA， combination of 18S-ACT or 18S-TUA， could be considered as candidate reference gene（s） for qRT-PCR study of I. asprella.

Key words Ilex asprella；qRT-PCR；Reference gene

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）是目前公認(rèn)的用于分析基因表達(dá)水平的重要手段，具有靈敏度高、快速準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)材料和可信可靠的定量方法是對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確、客觀定量的前提[3]。定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)表所必需實(shí)驗(yàn)信息最低限度標(biāo)準(zhǔn)（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments， MIQE）對(duì)于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中必須考慮的因素和水平做出了具體的規(guī)定[4]。為了達(dá)到準(zhǔn)確的基因定量數(shù)據(jù)，必須充分考慮以下幾種因素的可靠性：起始模板的質(zhì)量和數(shù)量，存在于不同樣品間的抑制因子，另外，為盡量減少實(shí)驗(yàn)樣本間的誤差，采取適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)校正也很有必要。通常利用一個(gè)或幾個(gè)表達(dá)較為穩(wěn)定的看家基因（Housekeeping Genes，HKGs）作為內(nèi)參基因來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[5]。

理想的內(nèi)參基因應(yīng)在生物體各類型的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)因素條件下均恒定表達(dá)[6]。然而，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性并沒(méi)有很好的普遍性，即同一看家基因在不同物種或相同物種的不同組織中的表達(dá)水平可能存在較大的差異[7]。因此，通常需要從多個(gè)看家基因中篩選出表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的一個(gè)或一個(gè)以上的看家基因作為內(nèi)參基因。常用于篩選內(nèi)參基因的看家基因包括18S核糖體RNA（18S rRNA）、肌動(dòng)蛋白基因（Actin）、親環(huán)素蛋白（Cyclophili）、微管蛋白基因（Tubulin）和多素泛聚酶基因（UBQ）等。

冬青科植物崗梅Ilex asprella（Hook.et Arn.）Champ.ex Benth. 是嶺南地區(qū)民間常用的一種草藥。崗梅的根入藥即崗梅，具有清熱解毒、消腫祛瘀的功能[8]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，崗梅的主要化學(xué)成分為烏索烷型三萜皂苷。本課題組在前期的研究中利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息分析，揭示了一系列可能參與崗梅根中三萜皂苷生物合成的候選基因片段[9]；對(duì)崗梅不同組織部位中三萜皂苷積累量的研究結(jié)果表明，崗梅的根和葉子很可能是三萜皂苷主要的合成和貯存部位，而莖的三萜皂苷貯存量卻很低[10]。因此，進(jìn)一步對(duì)崗梅不同組織部位中三萜皂苷合成酶相關(guān)基因進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證有助于闡明崗梅中三萜皂苷的生物合成途徑，進(jìn)而為烏索烷型三萜皂苷的生物合成研究奠定基礎(chǔ)?；虻谋磉_(dá)水平研究可有效幫助鑒定出實(shí)際參與三萜皂苷生物合成的基因。本研究的目的是利用qRT-PCR評(píng)價(jià)18S、ACT、TUA、TUB、CYP、EF-1α和UBQ共7個(gè)看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以篩選在崗梅不同組織器官中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的崗梅I. asprella為種植兩年生的盆栽植株，來(lái)源于廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣南嶺藥業(yè)種植基地，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員鑒定。植株分為須根（Fibrous roots，F(xiàn)R）、根皮（Root bark，RB）、根木質(zhì)部（Root xylem，RX）、莖皮（Stem bark，SB）、莖木質(zhì)部（Stem xylem，SX）、嫩枝（Twig，TW）、幼葉（Tender leave，TL）和成熟葉（Mature leave，ML）等8個(gè)不同的取材部位。除葉子外，其他部位均用干凈的解剖刀切成厚約1 mm的薄片，液氮處理后于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑RNAiso Plus、Fruit-mate for RNA Purification及反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent with gDNA Eraser、RNase-free H2O、DNA Marker等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa），2×power Taq Master Mix PCR試劑購(gòu)自北京百泰克生物公司，qRT-PCR試劑Sso Fast Eva Green購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)生物科技有限公司（BioRad），其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 每個(gè)組織部位取3個(gè)不同的生物重復(fù)，分別為樣品A、樣品B和樣品C。總RNA的提取參照上述試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行（改善之處：在加入異丙醇沉淀核酸之前，先加入上清液1/4體積的高鹽溶液），制得的總RNA直接用于反轉(zhuǎn)錄或保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量總RNA用RNase-free H2O稀釋10倍，以RNase-free H2O為空白，用紫外分光光度儀測(cè)定其OD260、OD280、OD230和OD320的值；并取適量總RNA加 6×Loading buffer于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照PrimeScript RT Reagent with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書，各取樣品的總RNA 1 μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。所得cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Technote qPCR MIQE Guide（BioRad）中引物設(shè)計(jì)的原則，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)7個(gè)看家基因的qRT-PCR引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由華大基因公司合成，采用PAGE純化。

1.2.4 看家基因的普通PCR 利用表1中的各引物對(duì)各內(nèi)參基因進(jìn)行普通PCR以驗(yàn)證其可用性。PCR體系為2×power Taq Master Mix 10 μL，混合cDNA 1 μL，F(xiàn)orward 和Reverse引物（濃度10 μmol/L）各0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)溫度程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各PCR產(chǎn)物。

1.2.5 看家基因的qPCR分析 在熒光定量PCR管（BIO-RAD）中加入體積為20 μL的反應(yīng)體系：Sso Fast Eva Green 10 μL，各樣品的cDNA 1 μL（陰性對(duì)照NTC為ddH2O 1 μL），正向和反向引物（濃度10 μmol/L）各0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)溫度程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃溶解曲線分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。加樣完成后迅速放入CFX 96 real-time quantity PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。數(shù)據(jù)讀取由儀器自動(dòng)完成。

1.2.6 看家基因的擴(kuò)增效率和線性考察 隨機(jī)選取崗梅的第一鏈cDNA樣品，用ddH2O依次稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋5倍，即起始模板的濃度分別為1、1/5、1/25、1/125和1/625。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，按1.2.5的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

根據(jù)公式Q=E△Ct，利用Excel 2010對(duì)每個(gè)擴(kuò)增樣品的Ct值計(jì)算各內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量Q。其中E為基因擴(kuò)增效率（一般情況下將基因擴(kuò)增設(shè)為理想擴(kuò)增，擴(kuò)增效率E默認(rèn)為2），△Ct=Ctmin-Ct樣品（Ctmin為所有樣品中最低的Ct值，Ct樣品為每個(gè)樣品的Ct值）[11]。

根據(jù)7個(gè)常用的看家基因在崗梅不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量，利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper共3個(gè)軟件對(duì)每個(gè)看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA樣品的質(zhì)量分析

各總RNA樣品的OD值見(jiàn)表2，A260/A280和A260/A230均>1.8，且濃度適宜，表明其純度較高，均可滿足下游反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的要求。由圖1可知，各總RNA樣品均呈現(xiàn)28S、18S和5S共3條清晰的條帶，28S條帶亮度約為18S條帶的2倍，表明各樣品的完整性較好。

2.2 看家基因的普通PCR分析

各看家基因的普通PCR結(jié)果均可見(jiàn)預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物（圖2），且條帶單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增，表明引物設(shè)計(jì)成功，各引物可用于后續(xù)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

2.3 看家基因的擴(kuò)增效率和線性分析

以5倍梯度稀釋的cDNA為模板，對(duì)7個(gè)看家基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，結(jié)果顯示，各看家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2≥0.990，說(shuō)明它們的線性關(guān)系很好。另外，各看家基因的擴(kuò)增效率均在90%～105%，且熔解曲線均只產(chǎn)生單一的熔解峰，不存在引物二聚體等非特異擴(kuò)增，各技術(shù)重復(fù)的樣品間的重復(fù)性良好。上述結(jié)果表明各看家基因的擴(kuò)增效率和線性均符合要求。

2.4 看家基因的Ct值分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明，7個(gè)看家基因在崗梅8個(gè)不同部位不同組織部位中的Ct值在21～35（圖3）?；虻谋磉_(dá)量與其Ct值呈反比關(guān)系。表達(dá)量最高的是18S，其Ct值在21～25；表達(dá)量最低的是EF-1α，其Ct值在29～35。說(shuō)明各看家基因的表達(dá)量存在較大的差別。

2.5 內(nèi)參基因的篩選

GeNorm軟件的計(jì)算結(jié)果是以M值來(lái)反映基因的穩(wěn)定性，M值越小則表明基因的穩(wěn)定性越高[12]。利用GeNorm軟件對(duì)各內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量Q進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明7個(gè)看家基因的M值均小于1.5（圖4）。各看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性各異，表達(dá)穩(wěn)定程度由高到低的順序?yàn)門UA=18S>ACT>EF-1α>CYP>UBQ>TUB。

NormFinder基于方差分析評(píng)價(jià)內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性[13]。利用NormFinder分析7個(gè)看家基因在崗梅不同部位中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明各看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性均低于1.2（圖5），穩(wěn)定性大小順序?yàn)椋篈CT>TUA>18S>EF-1α>CYP>UBQ>TUB。

BestKeeper軟件可直接根據(jù)看家基因的Cp值（或稱Ct值），分析標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)和變異相關(guān)系數(shù)來(lái)判斷其表達(dá)穩(wěn)定性[14]。上述2個(gè)參數(shù)的值越小則表示基因越穩(wěn)定；而標(biāo)準(zhǔn)偏差>1則被認(rèn)為該基因的表達(dá)不穩(wěn)定。另外，BestKeeper將候選基因組合成一個(gè)指數(shù)，并通過(guò)重復(fù)配對(duì)相關(guān)性分析評(píng)價(jià)每個(gè)候選基因與該指數(shù)的相關(guān)性。從表3可看出，TUB、EF-1α和UBQ的Cp值標(biāo)準(zhǔn)偏差均>1，較為不穩(wěn)定；CYP雖然Cp值變異小，但相關(guān)性分析結(jié)果表明它與其他的基因相關(guān)性較差（表4）；移除上述4個(gè)不合格的基因后，剩下的18S、TUA和ACT基因的相關(guān)系數(shù)均>0.900（表5）。上述分析結(jié)果表明，7個(gè)看家基因的穩(wěn)定性大小順序?yàn)椋篈CT>TUA>18S>CYP>TUB>EF-1α>UBQ。

綜上所述，3個(gè)軟件的分析結(jié)果均表明，18S、ACT和TUA看家基因的穩(wěn)定性和相關(guān)性均較好，可作為崗梅基因研究的內(nèi)參基因；其他4個(gè)看家基因的穩(wěn)定性相對(duì)較差，不適合作崗梅基因研究的內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

GeNorm、NormFinder和BestKeeper共3個(gè)軟件是最常用的基因穩(wěn)定性的分析軟件。在本研究中，3個(gè)軟件的分析結(jié)果并不完全一致，可能是由于這3個(gè)軟件的算法和評(píng)價(jià)指標(biāo)不同所致，而且這種現(xiàn)象也存在于其他物種的研究中[15]。盡管如此，3個(gè)軟件的分析結(jié)果均表明，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的前3個(gè)基因均為18S、ACT和TUA。18S是細(xì)胞胞質(zhì)核糖體小亞基，在多數(shù)物種中均有較高的表達(dá)水平，已成為水稻等物種的內(nèi)參基因[16]；而ACT和TUA均編碼細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，在功能上具有相似性，分別是葡萄和番茄的內(nèi)參基因[17-18]。如果考慮用2個(gè)編碼不同生物功能蛋白的基因配對(duì)作為崗梅的內(nèi)參基因，可選擇18S-ACT或18S-TUA組合。

理想的內(nèi)參基因，不僅在生物體的不同類型細(xì)胞和組織中穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)應(yīng)不受環(huán)境、生物和非生物脅迫等的影響[12]。但實(shí)際上，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性是相對(duì)的。研究者應(yīng)根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)樣品類型和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)篩選合適的內(nèi)參基因[7]。本研究篩選得到的3個(gè)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的看家基因，是適用于崗梅不同組織部位中基因表達(dá)水平研究的內(nèi)參基因，為崗梅不同組織部位的基因表達(dá)水平研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，利用茉莉酸甲酯刺激有利于誘導(dǎo)生物合成類基因的表達(dá)水平調(diào)整。因此，對(duì)崗梅進(jìn)行不同組織或不同濃度茉莉酸甲酯刺激，考察上述3個(gè)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因的表達(dá)水平，有助于進(jìn)一步篩選最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

參考文獻(xiàn)

[1] Radonic A， Thulke S， Mackay I M， et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2004， 313（5）： 856-862.

[2] Grant P R， Garson J A， Ayliffe U， et al. Real-time PCR quantitation of hepatitis B virus DNA using automated sample preparation and murine cytomegalovirus internal control[J]. J Virol Methods， 2005， 126（1-2）： 207-213.

[3] Ginzinger D G. Gene quantification using real-time quantitative PCR： An emerging technology hits the mainstream[J]. Exp Hematol， 2002， 30（6）： 503-512.

[4] Bustin S A. The MIQE guidelines： Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clin Chem， 2009， 55（4）： 611-622.

[5] 萬(wàn)紅建， 袁 偉，楊悅儉. 植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的特點(diǎn)及選擇[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2012， 47（4）： 427-436.

[6] Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time reverse trascription PCR RT-PCR： trends and problems[J]. J Mol Endocrinol， 2002， 29（1）： 23-29.

[7] 范成明， 胡瑞波，傅永福. 植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技學(xué)報(bào)， 2009， 11（6）： 30-36.

[9] Zheng X S， Xu H， Ma X Y， et al. Triterpenoid saponin biosynthetic pathway profiling candidate gene mining of the Ilex asprella root using RNA-Seq[J]. Int J Mol Sci， 2014， 15（4）： 5 970-5 987.

[10] 鄭夏生. 崗梅轉(zhuǎn)錄組及三萜皂苷生物合成相關(guān)酶基因的挖掘[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2014.

[11] 劉成前， 吳文凱，周志剛. 用于萊茵衣藻熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因選擇[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（4）： 667-672.

[12] De Preter K， Vandesompele J， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol， 2002， 3（7）：1-11.

[13] Jensen J L， Andersen C L， Qrntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Res， 2004， 64（12）： 5 245-5 250.

[14] Tichopad A， Michael W， Neuvians P， et al. Determination of stable housekeeping genes， differentially regulated target genes and sample integrity： BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters， 2004， 26（3）： 509-515.

[15] 孫 鵬， 侯維海， 陳全家，等. 地黃實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（17）： 76-82.

[16] Nam H Y， Kim B R， Kim S U， et al. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice[J]. Biotechnol Lett， 2003， 25（10）： 1 869-1 872.

[17] Olsson N， Reid K E， Schlosser J， et al. An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development[J]. BMC Plant Biol， 2006， 6（1）： 27.

[18] Davis E， Coker J S. Selection of candidate housekeeping controls in tomato plants using EST data[J]. Biotechniques，2003，35（4）：740-742，744，746.