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    一例I型鴨病毒性肝炎及其高免卵黃抗體的制備

    2015-05-30 10:48:04王蕾劉玉慶宋道禎付石軍常維山
    家禽科學(xué) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:混合感染

    王蕾 劉玉慶 宋道禎 付石軍 常維山

    摘 ?要:對(duì)山東省蒙陰縣某疑似鴨肝炎發(fā)病鴨肝臟進(jìn)行超薄片電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)兩種不同的病毒顆粒,RT-PCR鑒定,確診發(fā)病鴨為I型鴨病毒性肝炎和禽流感混合感染。用該鴨肝炎毒株接種易感雛鴨,取病死鴨肝臟,制備組織滅活苗,并加以不同的疫苗佐劑,設(shè)置蜂膠組、黃芪組及不加佐劑的對(duì)照組三組。按照免疫程序免疫高產(chǎn)蛋雞,收集高免蛋。通過(guò)中和試驗(yàn)對(duì)三組卵黃抗體的效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定,選擇效價(jià)較高的卵黃抗體將其應(yīng)用于臨床發(fā)病雛鴨的治療。

    關(guān)鍵詞:鴨病毒性肝炎;混合感染;卵黃抗體

    中圖分類(lèi)號(hào):S858.325.3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B ? ? 文章編號(hào):1673-1085(2015)06-0013-04

    鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起雛鴨的一種高度致死性、急性傳染病,是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。本病多發(fā)生于3周齡內(nèi)的雛鴨,1周齡左右的雛鴨最易發(fā)生。病死鴨多呈角弓反張樣外觀,其肝臟常有特征性的出血性病變,以肝炎為其主要特征。2014年3月,山東蒙陰某肉鴨場(chǎng)7日齡雛鴨出現(xiàn)大批死亡,病死率高達(dá)80%,病死鴨呈現(xiàn)角弓反張,剖檢可見(jiàn)肝臟明顯的出血點(diǎn)。

    1 ?材料

    1.1 ?病料來(lái)源 ?山東蒙陰縣疑似鴨肝炎病死雛鴨肝臟。

    1.2 ?主要試劑 ?反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV),Promega公司生產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RNase Inhibitor)、dNTP、rTaq DNA聚合酶、DNA marker,TaKaRa公司生產(chǎn);Trizol,invitrogen公司生產(chǎn)。

    2 ?方法

    2.1 ?肝組織電鏡標(biāo)本制備及觀察 ?取活的發(fā)病雛鴨的肝臟切成小薄片,存放于盛有2.5% 戊二醛的瓶中,4℃冰箱固定2h以上。取出切片0.1M磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗,漂洗3次,每次45min。用1%鋨酸進(jìn)行后固定,1h左右,再漂洗。脫水、包埋聚合后制成超薄切片,用飽和醋酸鈾染色30min,檸檬酸鉛染色5~8min。H-7000型透射電子顯微鏡對(duì)肝臟超薄片進(jìn)行觀察。

    2.2 ?雞胚半數(shù)致死量測(cè)定(ELD50) ?將病料加生理鹽水勻漿后取上清,反復(fù)凍融3次,用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,0.2ml/胚經(jīng)尿囊腔接種到9日齡的雞胚5枚,另取2枚雞胚接種滅菌生理鹽水0.2ml/胚作對(duì)照,置37℃溫箱培養(yǎng),并逐日觀察記錄結(jié)果,收集死亡雞胚尿囊液。

    將有明顯病變的尿囊液用雙抗生理鹽水進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋?zhuān)缓笥每讖綖?.22μm的一次性濾器過(guò)濾,分別取10-2~10-8 7個(gè)稀釋梯度的病毒液接種到9日齡的雞胚尿囊腔中,0.2ml/胚,每個(gè)梯度接種5個(gè)雞胚,封口,并做好標(biāo)記,在37℃的溫箱中孵化,每12h照一次雞胚,24h內(nèi)死亡的雞胚棄掉,記錄5d內(nèi)胚胎死亡時(shí)間及數(shù)量。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算雞胚半數(shù)致死量ELD50。

    2.3 ?混合感染的RT-PCR診斷

    2.3.1 ?引物設(shè)計(jì) ?根據(jù)Genbank已發(fā)表的 DHV-I 基因組序列和禽流感病毒核蛋白基因(NP)序列,利用DNAstar生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)合成并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成兩對(duì)鑒定引物,引物序列為:

    2.3.2 ?病毒RNA的提取 ?參照Trizol法提取,按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    2.3.3 ?RT-PCR反應(yīng) ?反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按20μl體系進(jìn)行,反應(yīng)條件為42℃ 20min,85℃ 5s。

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)以25μl反應(yīng)體系進(jìn)行:10×Buffer緩沖液2.0μl,dNTP 2.0μl,上下游引物各0.5μl,cDNA模板1μl,rTaqDNA 聚合酶0.5μl,加水至25μl。

    鴨肝炎病毒RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?4℃4min預(yù)變性,再進(jìn)行94℃ 45s,54℃ 45s,72℃ 45s 的反應(yīng)循環(huán),共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,于4℃結(jié)束反應(yīng)。

    禽流感病毒PCR反應(yīng)條件為:先94℃ 5min 預(yù)變性,再進(jìn)行94℃ 1min,54℃ 45s,72℃ 45s 的反應(yīng)循環(huán),共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,于4℃結(jié)束反應(yīng)。

    PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行鑒定。

    2.4 ?I型鴨肝炎組織滅活苗的制備

    2.4.1 ?病料處理 ?無(wú)菌取病死雛鴨肝臟作為材料,并去除被膜、結(jié)締組織及膽囊。將病料稱(chēng)重,加入等量生理鹽水,置于組織搗碎機(jī)中迅速勻漿3~5min,并用4層滅菌紗布過(guò)濾,濾渣反復(fù)勻漿,合并濾液。在濾液中加入甲醛,使其終含量為0.4%,充分搖勻,等量分裝于三個(gè)玻璃瓶中,標(biāo)記為1、2、3號(hào)。用玻塞蓋口再用溶蠟密封,置于37℃環(huán)境中作用24h,每3h振搖一次,使其充分滅活。1號(hào)、2號(hào)滅活苗中分別加入蜂膠和黃芪多糖為佐劑,3號(hào)不加作對(duì)照。

    2.4.2 ?無(wú)菌檢驗(yàn) ?取制備的滅活苗分別接種于LB平板、血平板及厭氧肉湯,37℃培養(yǎng)24~48h,觀察到?jīng)]有細(xì)菌生長(zhǎng)。

    2.4.3 ?安全試驗(yàn) ?選20只3日齡易感健康雛鴨,分為2組分別于背煩交界處皮下注射滅活苗2ml/只,并作空白對(duì)照,觀察9d,無(wú)異常情況。

    2.5 ?高免卵黃抗體的制備

    2.5.1 ?疫苗免疫 ?取160日齡試驗(yàn)蛋雞60只,分為三組,隔離飼養(yǎng)一周,無(wú)異常情況。第1次免疫滅活苗1ml/只,間隔10d進(jìn)行第2次免疫2ml/只,再間隔10d進(jìn)行第3次免疫2ml/只。

    2.5.2 ?卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定 ?采用雞胚中和試驗(yàn)法測(cè)定卵黃抗體的中和效價(jià),每組分別吸取5×1 ml卵黃,并作倍比稀釋?zhuān)?8~212 5個(gè)稀釋度的卵黃抗體與等量200ELD50病毒液混合,經(jīng)37℃中和1h后,接種10日齡SPF雞胚,0.2ml/枚,各5枚,同時(shí)設(shè)對(duì)照組。8d內(nèi)觀察雞胚死亡情況,按Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價(jià)。

    2.6 ?高免卵黃抗體治療DVH效果 ?在山東蒙陰縣選擇森泉家禽合作社的小型蛋雞場(chǎng),正常飼喂1周后無(wú)異常情況出現(xiàn),使用黃芪組織滅活苗進(jìn)行免疫,免疫三次后收集產(chǎn)蛋,將卵黃用生理鹽水稀釋10倍,4℃靜置過(guò)夜。

    通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀對(duì)發(fā)病鴨群進(jìn)行初步診斷,然后對(duì)死亡雛鴨進(jìn)行病理解剖,主要觀察肝臟的病變,對(duì)有典型病變的鴨群立即使用上步中制備的高免卵黃抗體進(jìn)行治療,方法是每只雛鴨頸部皮下注射1ml。觀察記錄卵黃抗體對(duì)該病的治愈率。

    3 ?結(jié)果

    3.1 ?電鏡觀察結(jié)果 ?見(jiàn)圖1。

    3.2 ?ELD50測(cè)定結(jié)果 ?見(jiàn)表2。

    根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得ELD50為(0.2ml)l06.659稀釋的病毒液。

    3.3 ?RT-PCR診斷結(jié)果 ?病死雛鴨的肝臟組織用所設(shè)計(jì)的I型鴨肝炎和禽流感特異性引物分別進(jìn)行RT-PCR,經(jīng)條件優(yōu)化,成功擴(kuò)增出目的片段,與預(yù)期片段大小相符,鑒定為I型鴨肝炎和禽流感混合感染。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂搪凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

    3.4 ?卵黃抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果 ?見(jiàn)表3。

    據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得蜂膠組卵黃抗體效價(jià)為29,黃芪組卵黃抗體效價(jià)為210.8,對(duì)照組卵黃抗體效價(jià)為27.82。黃芪組效價(jià)明顯高于其它二者。

    3.4 ?高免卵黃抗體治療DVH效果 ?蒙陰縣森泉家禽養(yǎng)殖合作社一肉鴨場(chǎng),1200羽發(fā)病,發(fā)病日齡為4日齡,發(fā)病后緊急注射高免卵黃抗體后,僅有13只發(fā)病雛鴨死亡,治愈率達(dá)98.9%。

    苗家溝養(yǎng)鴨散戶550羽3日齡發(fā)病雛鴨,經(jīng)緊急注射后,治愈率達(dá)98.2%。

    從臨床治療效果看,高免卵黃抗體對(duì)鴨病毒性肝炎的治療效果顯著。

    4 ?討論

    在臨床中,雛鴨病毒性肝炎與水禽流感混合感染的病例有很多。病毒性肝炎以肝臟腫大、表面有點(diǎn)狀或淤斑樣出血及腎臟腫大出血為特征;如發(fā)病鴨在出現(xiàn)鴨肝炎病癥同時(shí)伴有一定的神經(jīng)癥狀和病死鴨的心肌及胰腺壞死或出血點(diǎn)的特征性病變,即有可能伴有水禽流感的感染。治療時(shí)可用鴨肝炎卵黃抗體和禽流感卵黃抗體進(jìn)行緊急接種,同時(shí)使用金剛烷類(lèi)、恩諾沙星類(lèi)抗生素控制后期病毒、細(xì)菌的混合感染。黃芪多糖是中藥黃芪中主要的天然活性成分,具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘生干擾素等作用。在組織滅活苗制備過(guò)程中加入黃芪多糖可更有效地增加免疫效果,從而獲得效價(jià)較高的卵黃抗體,即可應(yīng)用于臨床鴨肝炎發(fā)病緊急治療。

    參考文獻(xiàn):

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    [2] ?陳建紅,辛朝安,張洛培,等.鴨病毒性肝炎診斷與防制要點(diǎn)[J].中國(guó)家禽,2000,22(11):37-39.

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    [4] ?范文明,張菊英,羅函祿,等.鴨病毒性肝炎鴨胚滅活疫苗的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).1993,24(4):354-358.

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