生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料中營(yíng)養(yǎng)成分和微生物群落研究

趙國(guó)華　方雅恒　陳貴

摘要 [目的] 探討發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下不同使用年限微生物群落的變化以及不同使用時(shí)間、不同深度的發(fā)酵床墊料中墊料組分的變化。[方法] 采用常規(guī)分析方法測(cè)定樣品中的營(yíng)養(yǎng)成分含量，對(duì)不同年限樣品中微生物分離提純后，結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定對(duì)其微生物群落進(jìn)行分析。[結(jié)果] 隨著發(fā)酵床使用時(shí)間的延長(zhǎng)，墊料中的總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分和粗蛋白含量均顯著增加，而水分含量降低不明顯；使用1年和2年的墊料從上層到下層總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低，不同使用時(shí)間、不同深度發(fā)酵床墊料中糞尿組水分、總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分、粗蛋白均高于其他組。隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料中微生物群落的多樣性有降低的趨勢(shì)。芽孢桿菌屬細(xì)菌和梭菌屬細(xì)菌在1年期樣品和2年期樣品中都是優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)豬生物發(fā)酵床墊料中有機(jī)質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用。[結(jié)論]該研究可為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵床；微生物；多樣性；成分

中圖分類號(hào)：S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-098-02

規(guī)?；酿B(yǎng)殖推動(dòng)了我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但是隨之帶來的環(huán)境污染問題也越來越引起人們的重視。發(fā)酵床養(yǎng)殖作為新型養(yǎng)殖技術(shù)，自從引入我國(guó)后被大力地推廣和使用，為解決畜牧環(huán)境污染問題帶來了新途徑。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是基于控制畜禽糞便排放與污染的一種新型環(huán)保型養(yǎng)殖技術(shù)，將鋸末、稻殼、秸稈等材料接種土著微生物菌種，堆積發(fā)酵后用作墊料，在經(jīng)過改造的豬舍內(nèi)加入上述有機(jī)墊料制成發(fā)酵床。在發(fā)酵床上養(yǎng)豬，糞尿會(huì)被墊料吸附，微生物降解其中的有毒有害物質(zhì)，同時(shí)利用產(chǎn)生的生物熱殺滅糞便中的腸道寄生蟲卵，從而達(dá)到降低養(yǎng)殖舍內(nèi)有害氣體濃度、減少養(yǎng)殖污染排放以及提高豬的生長(zhǎng)性能的目的[1-3]。發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的核心是墊料中微生物群落的活動(dòng)。筆者通過監(jiān)測(cè)嘉興某發(fā)酵床養(yǎng)豬場(chǎng)生長(zhǎng)肥育豬舍使用1年2年的不同深度發(fā)酵床墊料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分（水、粗蛋白、粗灰分、鈣）的變化以及氮、磷、鉀含量的變化，探索墊料中這些元素的累積情況及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并通過對(duì)豬生物發(fā)酵床樣品進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA擴(kuò)增、測(cè)序分析等，了解豬生物發(fā)酵床微生物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)酵床樣品均來由金鴻牧業(yè)有限公司提供。第1年和第2年的發(fā)酵床，采用對(duì)角線采樣法分別采集5個(gè)點(diǎn)的樣品（其中包含糞尿區(qū)）[3]，每個(gè)點(diǎn)分別從上至下用刀取0～15 cm（上層）、30～40 cm（中層）和60～70 cm（下層）的墊料樣品，同一深度各2.0 kg樣品混合，然后再采用四分法取500 g，備用。糞尿點(diǎn)各層單獨(dú)取樣各2.0 kg，單獨(dú)混勻?；旌戏椒ǎ簩⑷〉玫拿繉訅|料樣品混在一起，用四分法選取500 g，置于自封袋中密封，防止水分揮發(fā)，置于有冰袋的保溫盒中，貼上標(biāo)簽迅速帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 墊料的測(cè)定指標(biāo)及方法 水分含量測(cè)定：采集回的墊料用四分法選取500 g，先將墊料置于65 ℃烘箱烘至恒溫，用飼料粉碎機(jī)粉碎后通過40目篩，混勻樣品，裝入廣口瓶中貼上標(biāo)簽保存，待進(jìn)行其他各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[4]。全氮和全磷含量分別采用半微量凱氏定氮法和鉬黃顯色光度法測(cè)定；全鉀含量采用原子吸收分光光度法測(cè)定。

1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉50.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水溶解定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.6，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.4 微生物的分離、純化及保存 試驗(yàn)中分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基從稀釋的豬生物發(fā)酵床樣品中選擇性地分離細(xì)菌和放線菌，以供細(xì)菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。

1.5 細(xì)菌16SrDNA片段的擴(kuò)增 以細(xì)菌通用引物 27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TACGGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′為引物，豬生物發(fā)酵床分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μl）：25 μl 2×MightyAmp Buffer Ver.2（含Mg2+、dNTP plus），正反向引物各15 pmol，基因組DNA（直接挑菌作為基因組DNA模板），MightyAmp DNA Polymerase 1 μl。

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min， 30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl和2 μl上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣于濃度1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，于90 V電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后，立即在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照并存盤。

1.6 細(xì)菌RFLP酶切分型分析 克隆后，對(duì)陽性克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，酶切DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所得DNA帶型圖譜通過凝膠分析軟件進(jìn)行比對(duì)，然后選取不同的操作單元，并將對(duì)應(yīng)的陽性克隆子送交測(cè)序公司測(cè)序。

1.7 Blast比對(duì) 將測(cè)序結(jié)果在核酸數(shù)據(jù)庫（GenBank）中進(jìn)行Blast。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同深度發(fā)酵墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的變化 由表1可知，2年間不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水分含量均顯著高于其他組。使用第1年和第2年的發(fā)酵床墊料水分含量變化差異不顯著，這可能與發(fā)酵床墊料管理得好及定期深翻墊料有關(guān)。隨著墊料深度的增加，水分含量逐漸降低。墊料中的粗灰分主要來源于墊料組分及豬不斷排泄的糞污。該試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著墊料深度的增加，墊料粗灰分含量逐漸下降，這主要是由于豬的糞尿主要集中在表層的緣故。對(duì)比第1年和第2年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，墊料中粗灰分的濃度逐漸升高，表明粗灰分有累積作用。糞尿組各層顯著高于其他組。隨著墊料深度的增加，墊料中粗蛋白的濃度逐漸降低，這是由于糞尿中含有一定量的含氮化合物，因而墊料表層粗蛋白含量最高。隨著墊料使用時(shí)間的延長(zhǎng)，墊料中粗蛋白的濃度逐漸升高，表明粗蛋白具有累積作用。糞尿組顯著高于其他組。

2.2 2年間不同深度發(fā)酵床墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣含量 發(fā)酵床墊料中的總氮、總磷、總鉀和鈣含量主要來源于2個(gè)方面：一方面是墊料中的鋸末、秸稈和稻殼，另一方面是豬糞污。飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分被豬消化吸收后，排泄物主要是以糞污的形式不間斷排泄。由表2可知，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度隨墊料使用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。隨著墊料深度的增加，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低。糞尿組上、中、下層總氮、總磷、總鉀、鈣的濃度均明顯高于其他組上、中、下層。這表明豬的習(xí)性是群居，這不利于充分利用發(fā)酵床的功能特性。該試驗(yàn)結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[5-7]。

2.3 微生物總基因組DNA 將所采集到的樣品經(jīng)過前處理后，提取微生物總基因組DNA并進(jìn)行純化，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。從圖1可以看出，微生物總基因組DNA完整、無拖尾和雜帶，能滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.4 保育期不同年限樣品的16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果 將保育1年、保育2年的樣品分別與GeneBank 進(jìn)行Blastn序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)保育期1年的樣品微生物（相似度達(dá)99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、破傷風(fēng)桿屬（Clostridium sp.），藤黃單胞菌屬（Luteimonas sp.）、外硫紅螺菌屬（Ectothiorhodospria sp.）、海桿菌屬（Marinobacter sp.），假單胞菌屬（Pseudomonas sp）和索氏菌屬（Thauera sp）等。保育期2年的樣品中微生物（相似度達(dá)99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）、破傷風(fēng)桿屬（Clostridium sp.）、Uncultured bacterium，細(xì)桿菌屬（Microbacterium sp）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter sp）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp）、芽胞八疊球菌屬（Sporosarcina sp.）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）等。生物發(fā)酵床保育1年樣品中與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關(guān)的克隆子數(shù)有36個(gè)，占所有克隆子數(shù)的28.57%；與破傷風(fēng)桿屬（Clostridium sp.）相關(guān)的克隆子有32，占所有克隆子的35.40%，因此樣品中芽孢桿菌屬和破傷風(fēng)桿屬占優(yōu)勢(shì)。生物發(fā)酵床保育2年期樣品中克隆子較多的序列歸屬于芽孢桿菌屬和破傷風(fēng)桿屬有克隆子27個(gè)和23個(gè)，分別占21.60%和18.40%，在樣品中占有優(yōu)勢(shì)，為優(yōu)勢(shì)菌。

芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭菌屬（Clostridium）在生物發(fā)酵床保育期樣品中發(fā)揮著重要的作用，與其他研究結(jié)果相一致[8-9]。另外，有幾個(gè)序列與已知的細(xì)菌序列沒有任何的相似性，它們?cè)谏锇l(fā)酵床中的作用還需要進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

（1）不同使用時(shí)間、不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水

分、粗灰分、粗蛋白、總氮、總磷、總鉀和鈣含量均顯著高于其他組。

（2）從豬生物發(fā)酵床樣品中分離到的16SrDNA序列可以看出，隨著發(fā)酵床使用年限的增加，發(fā)酵床內(nèi)的微生物群落也在不斷地更替演變，保育2年時(shí)微生物群落的減少，說明隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料內(nèi)的微生物群落的多樣性有降低的趨勢(shì)。在保育期樣品中，芽孢桿菌屬和梭菌屬始終是獨(dú)立的的分支，對(duì)發(fā)酵床物質(zhì)代謝和能量代謝發(fā)揮著巨大的作用。

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