47份菠蘿種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD分析

王健勝 賀軍虎 陳華蕊 陳業(yè)淵

摘 ?要 ?利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自9個(gè)不同國(guó)家或區(qū)域47份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，RAPD標(biāo)記在菠蘿種質(zhì)中具有較好的多態(tài)性，引物多態(tài)性條帶百分比平均達(dá)到82.26%，引物的有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）表現(xiàn)都較好，其平均值分別為1.46、0.26、0.39和0.24?；赗APD分子檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)菠蘿種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析，在GS=0.66水平上，47份菠蘿種質(zhì)被劃分為4大類(lèi)群。菠蘿種質(zhì)的主成分分析獲得了與聚類(lèi)分析基本一致的結(jié)論。

關(guān)鍵詞 ?菠蘿;遺傳多樣性;RAPD標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào) ?S668.3 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Genetic Diversity Analysis of Forty Seven Pineapple

[Ananas comosus（L.）Merr]Germplasm

with RAPD Marker

WANG Jiansheng2， HE Junhu1 *， CHEN Huarui1， CHEN Yeyuan1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Pingdingshan University， Pingdingshan， Henan 467000， China

Abstract ?The genetic diversity of forty seven pineapple germplasm originated from nine countries/regions was analyzed using RAPD molecular markers. Results showed that RAPD had better polymorphsim in pineapple and the mean value for the percentage of polymorphism bands was 82.26%. RAPD primers had better performance on other genetic parameters as well， the mean value for effective number of allele， Neis gene diversity， Shannons information index and polymorphism information content was 1.46， 0.26， 0.39 and 0.24， respectively. Based on the genetic similarity coefficient between pineapple germplasm generated from RAPD markers， all the germplasms were clustered into four groups at the genetic similarity of 0.66. The similar results were also obtained by principal component analysis. All these results would provide an important scientific basis for breeding， preservation and effective utilization of pineapple in China.

Key words ?Pineapple; Genetic diversity; RAPD marker

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.005

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]屬鳳梨科鳳梨屬，是一種重要的多年生常綠草本植物，與香蕉、芒果、椰子并稱(chēng)四大熱帶水果。菠蘿在中國(guó)也具有較長(zhǎng)的種植歷史，其主要分布于臺(tái)灣、海南、廣西、云南等熱帶亞熱帶地區(qū)，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)菠蘿種植面積在2013年已達(dá)到5.8×104 hm2（Faostat 2013），這也使中國(guó)成為世界上菠蘿的主要生產(chǎn)國(guó)之一。雖然如此，與其他菠蘿主要種植國(guó)相比，我國(guó)的菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)滯后，而加快菠蘿育種是提升菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要工作。

種質(zhì)研究是菠蘿育種的重要基礎(chǔ)。雖然我國(guó)不是菠蘿的起源國(guó)，但經(jīng)過(guò)多年的有效引種，我國(guó)已保存了較為豐富的菠蘿種質(zhì)資源，因此，開(kāi)展菠蘿種質(zhì)研究已顯得尤為重要。目前，菠蘿種質(zhì)研究中有關(guān)田間表型性狀的研究較多[1-5]，利用分子標(biāo)記進(jìn)行菠蘿種質(zhì)研究的報(bào)道較少。劉衛(wèi)國(guó)等[6]利用8對(duì)AFLP引物對(duì)39份菠蘿種質(zhì)作了研究，結(jié)果表明，菠蘿種質(zhì)間的遺傳關(guān)系較近，其遺傳相似系數(shù)為0.73～0.98，基于遺傳相似系數(shù)，39份菠蘿種質(zhì)被分為4類(lèi)。竇美安等[7]利用SRAP標(biāo)記研究了61份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)供試菠蘿品種的多態(tài)性比率都較低，其分布在47.32%～68.90%之間，菠蘿種質(zhì)之間遺傳差異也較小，其遺傳相似系數(shù)都在0.80以上，61份菠蘿種質(zhì)最終被劃分為5種類(lèi)型。童和林等[8]利用菠蘿EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建了31份菠蘿種質(zhì)DNA指紋圖譜。陳香玲等[9]、張如蓮等[10]分別利用SCoT和ISSR對(duì)菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了分子鑒定及親緣關(guān)系分析。國(guó)外學(xué)者在相關(guān)方面也作了較好的研究[11-12]。

RAPD標(biāo)記是一種較早開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，由于其具有易擴(kuò)增、多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)便、無(wú)種屬限制等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于不同類(lèi)型植物遺傳多樣性研究中，另外，由于菠蘿其他類(lèi)型分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)數(shù)量仍較少，因此，本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自不同國(guó)家的47份菠蘿栽培種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在初步掌握不同菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良變異的菠蘿種質(zhì)，為我國(guó)菠蘿種質(zhì)的科學(xué)鑒定、保護(hù)和高效利用提供一定的基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

本實(shí)驗(yàn)于2013年在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物資源遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 ?材料

試驗(yàn)所利用的47份菠蘿種質(zhì)材料來(lái)源于9個(gè)不同國(guó)家或區(qū)域（表1），主要包括中國(guó)臺(tái)灣、中國(guó)海南、巴西、日本、印度尼西亞、澳大利亞、泰國(guó)、哥斯達(dá)黎加、毛里求斯。試驗(yàn)材料由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ? 每份材料隨機(jī)選取10～15個(gè)單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[13]混合提取基因組總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，稀釋至適合工作濃度，備用。

1.2.2 ?RAPD標(biāo)記[12]檢測(cè) ? PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上完成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括1.5 μL基因組DNA 40 ng，1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL 10×PCR緩沖液（含Mg2+），2.0 μL底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。

RAPD-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?個(gè)循環(huán)（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min），37個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min），最后72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上保存分析，同時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)RAPD反應(yīng)都需要重復(fù)3次以上。用于菠蘿RAPD分析的引物序列見(jiàn)表2。

1.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

以0、1、9統(tǒng)計(jì)RAPD擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10[14]軟件通過(guò)非加權(quán)平均法（UPMGA）計(jì)算菠蘿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上作聚類(lèi)分析及主成分分析。采用POPGEN32軟件估算RAPD標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菠蘿種質(zhì)RAPD多態(tài)性分析

從表3可以看出，不同RAPD引物在菠蘿基因組擴(kuò)增中存在較大差異。單個(gè)引物擴(kuò)增總條帶分布在43～227之間，平均為113.13，擴(kuò)增多態(tài)性條帶分布范圍為68～140，平均為94，多態(tài)性條帶百分比分布在58.59%～100.00%之間，平均為82.26%，可見(jiàn)，RAPD引物在菠蘿基因組擴(kuò)增中多態(tài)性表現(xiàn)較好。在其他參數(shù)方面，不同引物間的差異也比較明顯。有效等位基因數(shù)（Ne）分布范圍為1.03～1.66、Neis基因多樣性指數(shù)（H）變異范圍為0.02～0.41，Shannons信息指數(shù)（I）變化主要在0.06～0.59之間，其平均值分別為1.46、0.26和0.39。多態(tài)性信息含量（PIC）是評(píng)價(jià)引物的一個(gè)重要參數(shù)，從表3可以看出，RAPD引物的多態(tài)性信息含量差異較大，其變異范圍為0.07～0.38，平均為0.24。從引物所有參數(shù)的綜合分析來(lái)看，OPA4和OPU18表現(xiàn)相對(duì)最好，其在菠蘿遺傳多樣性檢測(cè)分析中效率最高。

2.2 ?不同菠蘿種質(zhì)親緣關(guān)系分析

基于RAPD分子檢測(cè)數(shù)據(jù)獲得了菠蘿種質(zhì)間的Neis遺傳相似系數(shù)，菠蘿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)的差異較大，其變化范圍為0.156～0.969，平均為0.716。在所有菠蘿種質(zhì)中，來(lái)自哥斯達(dá)黎加的MD2-2分別與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的Creampine、來(lái)自日本的Bogoul間的遺傳相似系數(shù)最小，只有0.156，這說(shuō)明MD2-2與Creampine、Bogoul的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。另一方面，臺(tái)農(nóng)16-1與巴厘-1、巴厘-2與臺(tái)農(nóng)18間的遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.969，這表明其親緣關(guān)系最近。從菠蘿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)平均表現(xiàn)來(lái)看，我國(guó)菠蘿種質(zhì)的遺傳差異水平相對(duì)較高。

2.3 ?不同菠蘿種質(zhì)聚類(lèi)分析

利用Neis遺傳相似系數(shù)對(duì)47份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在遺傳系數(shù)0.66處，47份菠蘿種質(zhì)可被劃分為4個(gè)類(lèi)群，即類(lèi)群Ⅰ、類(lèi)群Ⅱ、類(lèi)群Ⅲ和類(lèi)群Ⅳ，其中第Ⅰ類(lèi)群最大，共包括42份菠蘿種質(zhì)，占研究菠蘿種質(zhì)總數(shù)的89.36%。由于第Ⅰ類(lèi)群包含的菠蘿種質(zhì)數(shù)量龐大，因此其又可被劃分為3個(gè)亞群，分別為Ⅰ-1亞群、Ⅰ-2亞群和Ⅰ-3亞群，其中第Ⅰ-1亞群包括的菠蘿種質(zhì)最多，達(dá)到了38個(gè)，而第Ⅰ-2亞群和Ⅰ-3亞群分別有1個(gè)和3個(gè)種質(zhì)。第Ⅱ類(lèi)群共包括了2個(gè)菠蘿種質(zhì)，即來(lái)自日本的OK-2和來(lái)自巴西的Perola-2，第Ⅲ類(lèi)群也由兩個(gè)菠蘿種質(zhì)組成，其分別是來(lái)自印度尼西亞的紅西班牙和來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的珍珠-2，與其他類(lèi)群不同，第Ⅳ類(lèi)群是由1個(gè)菠蘿種質(zhì)構(gòu)成的，即來(lái)自哥斯達(dá)黎加的MD2-2，這表明該種質(zhì)與其余菠蘿種質(zhì)的親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)，可以看出，該聚類(lèi)結(jié)果與上述親緣關(guān)系分析結(jié)果基本一致。

2.4 ?菠蘿種質(zhì)主成分分析

基于RAPD標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)47份菠蘿種質(zhì)作了主成分分析（圖2）。在主成分分析中，前3個(gè)主成分能解釋的總遺傳變異為41.77%。從圖2可看出，主成分分析獲得了與聚類(lèi)分析基本一致的結(jié)果，聚類(lèi)分析中被聚為同一類(lèi)群的菠蘿種質(zhì)在主成分分析中也具有較近的物理距離，而物理位置的大小也直接反映了其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可見(jiàn)，主成分分析在直接反映菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的同時(shí)，也在一定程度上印證了聚類(lèi)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。從圖2還可見(jiàn)，編號(hào)為30的MD2-2與其余菠蘿種質(zhì)間都具有較遠(yuǎn)的物理位置，這表明MD2-2與其他菠蘿種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，該結(jié)果與前述分析結(jié)果也基本一致。

3 ?討論與結(jié)論

目前，菠蘿品種在園藝學(xué)上的分類(lèi)仍主要依據(jù)菠蘿在果實(shí)、葉片、植株性狀等方面的差異來(lái)進(jìn)行，根據(jù)差異菠蘿品種主要被分為5大類(lèi)，即無(wú)刺卡因類(lèi)、皇后類(lèi)、西班牙類(lèi)、伯南布哥類(lèi)、佩羅萊拉類(lèi)。從本研究所獲得的菠蘿種質(zhì)資源親緣關(guān)系聚類(lèi)圖上可以看出，該結(jié)果與現(xiàn)行的經(jīng)典分類(lèi)結(jié)論既有一致的部分，也存在一定的差異，其主要原因可能是地區(qū)及國(guó)際間種質(zhì)頻繁交流而導(dǎo)致的同名異物、同物異名現(xiàn)象存在，造成了菠蘿品種名稱(chēng)的混亂，而本研究對(duì)菠蘿品種的分類(lèi)主要是依據(jù)其在分子水平的差異來(lái)進(jìn)行。另外，本研究在研究材料中也加入了部分國(guó)內(nèi)近年來(lái)選育的菠蘿新品系，初步確定了部分國(guó)內(nèi)新品系與國(guó)外引進(jìn)菠蘿品種間的親緣關(guān)系，在菠蘿新種質(zhì)中，“紅皮菠蘿”是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的菠蘿種質(zhì)，田間性狀初步評(píng)價(jià)認(rèn)為，其顏色鮮艷、果肉細(xì)膩，可溶性固形物含量高（TSS=14.3），接近國(guó)際流行品種金菠蘿（TSS=14.5），聚類(lèi)結(jié)果表明，“紅皮菠蘿”與國(guó)外引進(jìn)品種“珍珠”間具有較近親緣關(guān)系（GS=0.937 5），這表明該種質(zhì)選育可能來(lái)自“珍珠”的基因突變株系或與“珍珠”具有遺傳關(guān)系相近的親本;新種質(zhì)“新品系-1”和“新品系-2”均與臺(tái)農(nóng)系列品種親緣關(guān)系較近，這說(shuō)明它們的選育很可能來(lái)自臺(tái)農(nóng)系列品種。分子標(biāo)記技術(shù)在菠蘿種質(zhì)鑒定和生物多樣性分析研究中具有很大的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)分類(lèi)鑒定，它具有不受取材部位、發(fā)育階段和環(huán)境因素影響的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，結(jié)果可靠，尤其是 RAPD技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、不涉及同位素和多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用更廣泛，其彌補(bǔ)了菠蘿傳統(tǒng)分類(lèi)方法的不足，為菠蘿資源的收集、保存和科學(xué)利用提供了依據(jù)。

遺傳多樣性研究是菠蘿育種的重要基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性分析，不僅可以較為準(zhǔn)確的掌握不同菠蘿種質(zhì)的親緣關(guān)系，為菠蘿雜交育種中親本的選配提供重要科學(xué)依據(jù)，同時(shí)，也可以從已有菠蘿種質(zhì)中有效發(fā)現(xiàn)存在的優(yōu)良變異，為菠蘿育種提供豐富的優(yōu)異種質(zhì)材料。本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)47份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，我國(guó)菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性水平較高，種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)平均值達(dá)到了0.715 5，該結(jié)果與前人利用AFLP[6，15]、RFLP[11]、ISSR[10]和RAPD[12]等對(duì)菠蘿種質(zhì)的研究存在一定差異，這可能與本研究菠蘿種質(zhì)的來(lái)源較廣有關(guān)，這些菠蘿種質(zhì)來(lái)自世界上9個(gè)不同國(guó)家或地區(qū)，而地理位置的遠(yuǎn)近對(duì)菠蘿遺傳多樣性具有較大影響。通過(guò)聚類(lèi)分析和主成分分析，47份菠蘿種質(zhì)大致都可被劃分為4個(gè)類(lèi)群，該結(jié)果也比較準(zhǔn)確直觀的反映了不同菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系的基本狀況。在47份菠蘿種質(zhì)中，MD2-2表現(xiàn)出了較大的遺傳變異，其與其他菠蘿種質(zhì)間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這表明MD2-2是菠蘿育種的良好材料，如果選用其作親本配制雜交組合將獲得較好的育種效果。臺(tái)農(nóng)16-1與巴厘-1雖然在植物學(xué)性狀上存在一定的差異，前者為無(wú)刺，后者為有刺，但在本研究中卻被聚為一類(lèi)，且具有很高的遺傳相似系數(shù)（0.812 5），這可能與這兩個(gè)品種均來(lái)自同一父母本有關(guān)，這與竇美安等[7]的研究結(jié)果基本一致?！坝∧嵊写獭焙汀坝∧釤o(wú)刺”在植物學(xué)性狀上的差異主要是葉刺的有無(wú)，因此推測(cè)其可能來(lái)自同一菠蘿種質(zhì)在控制葉刺基因位點(diǎn)上的變異，本研究的分析結(jié)果較好的驗(yàn)證了這一點(diǎn)，這兩個(gè)種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)較高，達(dá)到0.875 0。由此可見(jiàn)，分子標(biāo)記更能從本質(zhì)上揭示不同菠蘿種質(zhì)間的差異及親緣關(guān)系。菠蘿遺傳多樣性研究不僅在菠蘿育種中發(fā)揮著重要作用，其在菠蘿種質(zhì)的有效保存、分類(lèi)和科學(xué)利用中也具有十分重要的功能。因此，本研究結(jié)果將為未來(lái)我國(guó)菠蘿種質(zhì)的深入研究和菠蘿高效育種提供一定的研究基礎(chǔ)。

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