百合病毒脫除技術(shù)研究進(jìn)展

豐先紅 李健 羅孝貴

摘要：百合病毒病是一類影響百合經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的重要病害，嚴(yán)重制約了百合商品生產(chǎn)的發(fā)展，去除百合病毒病最好的方法是采用脫毒培養(yǎng)技術(shù)獲得無病毒種苗，進(jìn)行無病毒種球生產(chǎn)。詳述了百合中常用的病毒脫除技術(shù)，包括莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)藥劑處理和多種方式結(jié)合應(yīng)用等幾種，以及近幾年新興的一種脫毒技術(shù)——低溫療法，指出百合病毒脫除研究新方向，以期為生產(chǎn)無病毒百合種苗提供參考。

關(guān)鍵詞：百合；病毒；脫毒

中圖分類號(hào)：S682.2+9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號(hào)：cjas15010034

0引言

百合是多年生球根花卉，種類和品系均多，花期長(zhǎng)，花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美。既能作切花、盆花，又能在園林中與喬、灌、草配置，可取得很好的景觀效果。全世界百合屬（Lilium）植物共有115種，其中原產(chǎn)中國(guó)的有55個(gè)種18個(gè)變種，占世界百合屬植物的一半。近年來隨著百合生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，種球幾代自繁和快速流通使得百合病毒病累積日趨嚴(yán)重，影響了百合的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及花、葉的觀賞價(jià)值，帶病毒的百合花色暗淡、葉片畸形，甚至植株枯死，不帶病毒的花色艷麗、植株高大、切花壽命長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、商品性優(yōu)，可在生產(chǎn)中廣泛推廣應(yīng)用。近年來，不少科研工作者利用莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)藥劑處理及多種方式結(jié)合等脫毒技術(shù)對(duì)百合病毒脫毒效果進(jìn)行研究，筆者介紹了百合主要病毒病及這些脫毒技術(shù)在百合上的研究情況，旨在為今后百合脫毒和無病毒種苗生產(chǎn)提供借鑒。

1侵染百合的主要病毒病

百合的病毒病最早研究來自于Stewart百合的壞死條紋。到目前為止，報(bào)道過的百合病毒共約有19種，植原體（phytoplasma）1種。其中百合潛隱病毒（Lily symptomless virus，LSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、郁金香碎花病毒（Tulip breaking virus，TBV）、異名百合斑駁病毒（Lilymottle virus，LM_oV）和百合叢簇病毒（Lily rosette virus，LRV）等5種病毒病是在百合種球生產(chǎn)中最普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的病毒，這些病毒主要通過蚜蟲等昆蟲介體傳播，傳播速度快，且難以用化學(xué)藥劑或生物制劑進(jìn)行直接有效防治。其他十幾種病毒僅在局部栽培地方發(fā)生，危害較小。

2百合病毒脫除技術(shù)

2.1莖尖培養(yǎng)脫毒

Phillips最早開展百合莖尖脫毒研究，此后莖尖脫毒技術(shù)就廣泛應(yīng)用于百合無病毒苗生產(chǎn)。莖尖組織培養(yǎng)脫毒是最簡(jiǎn)單、最有效的方法，是植物脫病毒方法中最常用的一種。此法能與快繁相結(jié)合，周期短、效率高。莖尖組織培養(yǎng)脫毒是否成功主要取決于莖尖的大小，剝?nèi)〉那o尖太小難以成活，過大則達(dá)不到脫毒效果。因此選擇適當(dāng)?shù)那o尖大小，兼顧脫毒率和成活率2個(gè)因素，是研究人員一直在探求的問題。邵增龍等認(rèn)為莖尖大小在0.2～0.3mm，脫病毒效果較好且易成活。王超等對(duì)5種百合進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)，認(rèn)為百合剝?nèi)?.3～0.8mm莖尖大小最適宜。張文珠等研究表明，直接剝?nèi)?.2～0.5mm的莖尖，脫毒效果比較理想，脫毒率可達(dá)到38%，0.5～1.0mm的莖尖效果最差。陳麗等在對(duì)食用百合（卷丹）脫毒工藝研究中成功將莖尖大小控制在0.1～0.2mm，脫毒成功率達(dá)到58.9%，成活莖尖的無病毒率達(dá)到l00%，打破了莖尖大小在0.3mm以下成活率極低甚至于完全不能成活的規(guī)律。

莖尖二次脫毒是在一次莖尖脫毒成苗后，再次剝?nèi)∏o尖脫毒，是對(duì)莖尖培養(yǎng)脫毒的改進(jìn)。張藝萍等對(duì)東方百合栽培品種‘Siberia進(jìn)行了二次莖尖脫毒效率研究，結(jié)果表明二次莖尖脫毒可剝?nèi)≥^大百合莖尖（0.4～0.6mm），且脫毒效果良好。鄭麗娜等認(rèn)為，經(jīng)過二次莖尖脫毒的莖尖成苗率和脫毒率高，污染率比較低。侯娜研究發(fā)現(xiàn)東方百合組培苗經(jīng)過1次莖尖脫毒培養(yǎng)和4次繼代脫毒培養(yǎng)后，可以完全脫除CMV和LSV病毒?？梢姡吻o尖脫毒比一次莖尖脫毒更易剝?nèi)∏o尖，脫除病毒，獲取脫毒材料。

2.2珠芽培養(yǎng)脫毒

珠芽培養(yǎng)脫毒是以田間植株上的珠芽或通過鱗片組培獲得的珠芽為材料，經(jīng)過消毒、無菌水沖洗，切取一定大小的珠芽生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。用珠芽作為外植體的優(yōu)點(diǎn)在于，數(shù)量多而個(gè)體小，便于采集和剝?nèi)?，帶菌量也比地下的鱗莖少得多，易于滅菌。以珠芽生長(zhǎng)點(diǎn)為材料脫毒成功與否也在于生長(zhǎng)點(diǎn)切取的大小。趙祥云等剝?nèi)?.3～0.8mm大小的珠芽生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，成功地去除了淡黃花百合組培苗的煙草環(huán)斑病毒（TRSV）。張建華等認(rèn)為以珠芽為材料進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，外植體不能大于1.0mm，0.3～0.8mm的外植體才能達(dá)到脫毒要求。李進(jìn)等切取宜興百合珠芽0.2～0.3mm生長(zhǎng)點(diǎn)分化培養(yǎng)，成功獲得脫毒組培苗，但并未檢測(cè)病毒脫毒率。

2.3熱處理脫毒

熱處理去除病毒主要原理是病毒受熱后不穩(wěn)定，活性鈍化，繁殖能力下降，失去浸染能力。影響熱處理脫毒效果的主要因素是溫度的高低和時(shí)間長(zhǎng)短，溫度越高和處理時(shí)間越長(zhǎng)脫毒效果越好，但存活率也越低，在實(shí)踐中通常在較高的溫度處理中縮短處理時(shí)間，較低溫度時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)處理時(shí)間，處理時(shí)間可以幾個(gè)小時(shí)、幾天或幾個(gè)月。處理溫度的高低因病毒抗熱性而異，CMV在25℃時(shí)就可以脫除，在30℃時(shí)LSV比LMoV更易脫除。張惠華等發(fā)現(xiàn)‘Sorbonne種球經(jīng)過（39±1）℃恒溫處理15天后，LSV整體脫毒效果均好于LMoV，相對(duì)容易脫除。熱處理脫毒簡(jiǎn)單易操作，但需要時(shí)間太長(zhǎng)，脫毒不完全，脫毒率較低，僅為20%～30%，脫除效果不佳。目前將熱處理與其他方法結(jié)合處理在百合脫毒研究中最為常用，相關(guān)報(bào)道較多。

2.4熱處理+莖尖/珠芽培養(yǎng)脫毒

熱處理與莖尖/珠芽培養(yǎng)結(jié)合脫毒的方法增強(qiáng)了脫毒效果、提高了試驗(yàn)的可操作性，兼顧了脫毒率和成活率2個(gè)因素。二者結(jié)合有2種方式，一是先對(duì)外植體進(jìn)行熱處理，再剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)，檢測(cè)病毒脫除效果。周曉波等對(duì)帶LSV病毒的卷丹百合珠芽在36℃高溫預(yù)處理10天，進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)過一次繼代培養(yǎng)后，用RT-PCR檢測(cè)LSV病毒，脫毒率達(dá)100%，成活率達(dá)92%。陳劍勇以‘索邦百合的小鱗莖為外植體，用50℃的熱水處理30min后，再切取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，脫毒率可達(dá)80%。徐品三等將感LSV病毒的鐵炮百合種球用37℃溫度處理20天后，快速繁殖的子球脫毒率達(dá)95%以上。席夢(mèng)利等將宜興百合珠芽經(jīng)過（50±1）℃熱水處理40min，培養(yǎng)30天后，切取了較大莖尖（0.8～1.0mm）培養(yǎng)，脫毒率達(dá)100%，表明二者結(jié)合處理時(shí)，可以剝?nèi)≥^大的莖尖培養(yǎng)，能獲得較好的脫毒效果。姜春華研究了東方百合雜交系的2個(gè)百合品種種球經(jīng)過一次高溫處理和莖尖培養(yǎng)脫毒后，組培苗再次經(jīng)過高溫處理和莖尖培養(yǎng)的脫毒效果，結(jié)果表明，不同品種的百合對(duì)遞進(jìn)熱處理脫毒的效果反應(yīng)不一致，‘凝星百合對(duì)高溫具有高溫鈍化現(xiàn)象。

二者結(jié)合的另一種方式是先剝?nèi)∏o尖或珠芽培養(yǎng)，再對(duì)試管苗進(jìn)行熱處理，也能較好地脫去病毒。張文珠以東方百合‘Tiber為材料，比較了莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理和單一莖尖培養(yǎng)的脫毒率，證實(shí)結(jié)合熱處理脫毒率比莖尖培養(yǎng)高。不同種病毒用不同方法脫除效果差異較大。高慧卿等以東方百合‘Tiber無菌苗為材料，研究發(fā)現(xiàn)僅用莖尖培養(yǎng)就能將CMV病毒較好的脫除，脫毒率達(dá)82.29%，用莖尖培養(yǎng)和熱處理結(jié)合脫毒才能將LSV病毒較好的脫除，脫毒率達(dá)到74.65%。

在二者結(jié)合處理中，可以將恒溫?zé)崽幚砀淖兂勺儨責(zé)崽幚恚涿摮《拘Ч脖容^好，試管苗成活率及脫毒率都要高于恒溫處理，相關(guān)報(bào)道也比較多。楊柏云等探索了變溫處理對(duì)龍牙百合小鱗莖病毒抑制作用依次為CMV、LSV、TBV、LRV。李巧峽等對(duì)西伯利亞百合試管苗用熱空氣變溫處理42天后莖尖培養(yǎng)，脫毒效果較好。江洪如等發(fā)現(xiàn)龍牙百合鱗莖經(jīng)過58、38℃變溫處理后莖尖培養(yǎng)，4種主要危害百合的病毒粒子可以完全脫除。鄭麗娜比較了5個(gè)百合品種變溫處理和恒溫處理莖尖脫毒效果及莖尖成活率，建議不耐高溫的品種采用變溫處理為好。

在變溫?zé)崽幚碇?，改變光暗培養(yǎng)條件對(duì)不同種病毒的脫除效果有明顯的差異。羅麗萍等發(fā)現(xiàn)龍牙百合小鱗莖經(jīng)過白天40～42℃、夜晚35℃變溫處理60天后脫毒效果最好。陳進(jìn)等以麝香百合雜種系品種‘雷山一號(hào)組培苗為材料進(jìn)行了脫毒試驗(yàn)，表明黑暗、變溫?zé)崽幚斫Y(jié)合試管鱗莖培養(yǎng)只對(duì)脫除百合植株CMV有效，脫毒率達(dá)90%以上；黑暗、變溫?zé)崽幚砗螅腥　?mm的莖尖進(jìn)行光培養(yǎng)能夠有效脫除CMV、LSV和LMoV 3種病毒，脫毒率達(dá)到93.3%。光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)條件對(duì)CMV脫除影響的差異不明顯，但暗培養(yǎng)對(duì)LMoV和LSV的抑制作用略優(yōu)于光培養(yǎng)。劉博在高溫變溫條件（白天38℃、10h，夜間32℃、14h）下對(duì)東方百合‘Tiber帶毒（LSV）商品球莖尖（2mm）進(jìn)行全暗培養(yǎng)1個(gè)月成功脫除LSV，而光暗交替培養(yǎng)則無效。

2.5化學(xué)藥劑處理+熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒

化學(xué)藥劑脫除病毒主要是利用孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、病毒唑等抗病毒藥劑來抑制病毒合成，達(dá)到脫除病毒的目的。這類藥劑不能使病毒失活，對(duì)寄主有害，應(yīng)少用。Kim通過在培養(yǎng)基中添加病毒唑獲得了百合無病毒苗。徐品三等發(fā)現(xiàn)‘卡薩布蘭卡的不定芽在添加有10mg/L DHT的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LSV脫除效果理想，病毒檢出率為零。

單獨(dú)使用化學(xué)藥劑脫除病毒的研究報(bào)道較少，大多都是與莖尖/珠芽培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合應(yīng)用。Xu-PinSan等通過熱處理和化學(xué)藥劑結(jié)合的方法獲得了70%的‘Georgia和94%‘Casablanca珠芽，病毒檢測(cè)呈陰性。屈云慧等將百合無菌分株苗植于MS+NAA 0.1mg/L+病毒唑5.0mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，剝?nèi)?.2～0.3mm莖尖培養(yǎng)，脫毒率達(dá)到58%。病毒唑、莖尖培養(yǎng)和熱處理三者相結(jié)合可獲得更好的脫毒效果。徐榕雪利用莖尖培養(yǎng)與病毒唑相結(jié)合方法成功脫除鐵炮百合‘雪皇后的CMV、LM_oV、LSV3種病毒。鄭麗娜等用5種脫毒方法研究百合無毒化種球繁育關(guān)鍵技術(shù)，結(jié)果表明病毒唑加熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)方法最好，一次性脫毒率可達(dá)到80%以上。楊柏云等認(rèn)為病毒唑可促使病毒鈍化，結(jié)合高溫和莖尖培養(yǎng)，可獲得無病毒苗。王超也證實(shí)莖尖培養(yǎng)（0.5～0.8mm）加熱處理（變溫?zé)崽幚恚┙Y(jié)合病毒唑（10mg/L）的相結(jié)合可使百合成活率及脫毒率達(dá)到較高水平。馬平霞對(duì)西伯利亞百合脫毒研究表明，2～3cm的試管苗經(jīng)38℃/16h光照和25℃/8h黑暗培養(yǎng)，熱空氣處理42天后，切取莖尖0.3～0.5mm，接于分化培養(yǎng)基+5mg/L病毒唑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，脫毒率達(dá)到70%，脫毒效果是所用預(yù)處理方式中最好的，但此研究結(jié)果不能排除光暗培養(yǎng)對(duì)病毒脫除效果的影響。

2.6低溫療法脫毒

低溫療法脫毒技術(shù)是以超低溫保存和植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的一種新興的脫毒方法，具有操作簡(jiǎn)單、快速、脫毒率高等優(yōu)點(diǎn)。Brison等最先利用超低溫保存結(jié)合莖尖離體培養(yǎng)方法，成功脫除李豆病毒（PPV），獲得了50%的健康植株。Helliot等利用低溫療法成功地脫除了香蕉中的2種病毒。Wang等發(fā)現(xiàn)超低溫處理結(jié)合熱處理可以脫除莖尖剝離結(jié)合熱處理無法去除的木莓叢矮病毒（RBDV）。此法在國(guó)外研究較多，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。戴軍等將太子參莖尖超低溫處理1h后增殖培養(yǎng)，脫毒率可達(dá)90%以上。蔡斌華等利用此法成功脫除草莓輕型黃斑病毒（SMYEV）。曹慶等剝?nèi)≥^大感染柑桔裂皮病的柑桔莖尖（2～2.5mm）進(jìn)行玻璃化超低溫保存處理，脫毒率也能達(dá)到88.2%。

百合利用此法脫毒研究的更少，但有低溫冷處理種球結(jié)合莖尖培養(yǎng)的報(bào)道。鐘海豐等比較了5種脫毒方法，認(rèn)為4℃冷藏處理百合種球莖尖培養(yǎng)的脫毒方法，脫毒效果最好，出芽率達(dá)到62.7%，脫毒率達(dá)到88.7%。張惠華對(duì)東方百合品種‘Sorbonne在2～4℃的冷庫(kù)休眠84天、15℃室內(nèi)催芽7天后，再綜合熱處理、莖尖培養(yǎng)和病毒抑制劑等手段脫毒，發(fā)現(xiàn)此法脫除病毒效果最好。靳慧潔首次研究了東方百合莖尖超低溫處理脫毒技術(shù)，結(jié)果表明培養(yǎng)20天左右的百合苗，經(jīng)液氮24h處理及在40℃水浴化凍后，剝?nèi)?.5～0.8mm莖尖的成活率和脫毒率較高，符合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

百合除了上述脫毒方法外，還有花藥培養(yǎng)、花絲培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)等方法脫毒，相關(guān)報(bào)道較少。

3小結(jié)與展望

綜上所述，在百合病毒脫除技術(shù)研究中，科研工作者為使脫毒率與成活率之間達(dá)到最好平衡點(diǎn)，應(yīng)用了莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)藥劑等基本的脫毒方法，但是這些方法都有其缺點(diǎn)。莖尖培養(yǎng)對(duì)操作技術(shù)人員要求較高；熱處理操作簡(jiǎn)單，脫毒時(shí)間長(zhǎng)，脫除效果不理想；化學(xué)藥劑只能抑制病毒合成，對(duì)寄主有害。因此，大多數(shù)工作者在這些基本方法上進(jìn)行了改進(jìn)和延伸，比如二次莖尖脫毒、恒溫變變溫脫毒、改變光暗培養(yǎng)條件、多種方法結(jié)合脫毒等方法，取得了很好的脫毒效果，一些百合的組培苗生產(chǎn)也已進(jìn)入了商業(yè)化階段，然而受病毒種類、百合品種、外植體選擇、培養(yǎng)基選配、溫度高低、光暗培養(yǎng)時(shí)間、脫毒方法及操作技術(shù)人員的水平等因素影響，脫毒效果差異較大。

如何提高現(xiàn)有脫毒技術(shù)的脫毒率、成活率及探索新的簡(jiǎn)便有效的脫毒方法是目前百合脫毒研究的重點(diǎn)。低溫療法是近年來新興的一種脫毒方法，其操作簡(jiǎn)單、快速、脫毒率高，更適合批量化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為植物脫去病毒帶來新的希望，已成功應(yīng)用于馬鈴薯、甘薯、葡萄、柑橘、覆盆子、香蕉等植物上。低溫療法利用超低溫對(duì)植物細(xì)胞殺傷程度不一致的原理脫去病毒：超低溫能夠殺死較大液泡含有病毒的頂端細(xì)胞，而保存液泡小的頂端分生組織細(xì)胞，這樣經(jīng)過超低溫處理的植物再生后就有可能是無病毒的。百合是集經(jīng)濟(jì)、觀賞于一體的花卉，在生產(chǎn)生活中應(yīng)用較廣。低溫療法若能成功應(yīng)用于百合脫毒，是極具廣闊市場(chǎng)前景的。因此，研究影響百合超低溫處理技術(shù)的因素，建立超低溫脫毒體系以及如何將超低溫脫毒與愈傷組織培養(yǎng)、熱處理、珠芽培養(yǎng)等脫毒方式相結(jié)合是未來百合脫毒研究的重點(diǎn)之重。在研究過程中，應(yīng)關(guān)注超低溫處理的機(jī)理性研究，注重培養(yǎng)機(jī)理和規(guī)律的總結(jié)，形成系統(tǒng)化的理論體系，并不斷在試驗(yàn)中予以檢驗(yàn)；著重對(duì)百合組培苗各階段的生長(zhǎng)特性、遺傳穩(wěn)定性、組培苗田間表現(xiàn)以及組織培養(yǎng)過程中生理生化的變化和植物內(nèi)源激素對(duì)其形態(tài)發(fā)生影響等方面研究。