Notch配體Delta-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

李 偉 胡紅梅 陳彩芬 黃玉珊

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院口腔系，江西 吉安 343000)

細(xì)胞間信號(hào)作用的相互影響是細(xì)胞增殖和分化的主要調(diào)控因素，Notch配體Delta-1信號(hào)途徑作為細(xì)胞間相互作用的一種主要通路，廣泛存在于各種動(dòng)物中，是調(diào)控包括牙髓干細(xì)胞(DPSC)在內(nèi)的多種干細(xì)胞的增殖和分化的信號(hào)途徑之一〔1〕。在對(duì)干細(xì)胞組織工程研究中發(fā)現(xiàn)，Delta-1表達(dá)增強(qiáng)可影響造血干細(xì)胞、DPSC和上皮細(xì)胞的增殖和分化，尤其在牙髓組織工程研究中，發(fā)現(xiàn)Delta-1在牙髓形成修復(fù)性牙本質(zhì)過程中具有重要意義，DPSC可作為Delta-1基因的受體細(xì)胞，與納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合后具有成牙本質(zhì)能力〔2〕。因此，Delta-1信號(hào)作為一種進(jìn)化保守性細(xì)胞間相互作用機(jī)制，可影響發(fā)育過程中多種細(xì)胞的分化、增強(qiáng)和凋亡。雖然研究發(fā)現(xiàn)，Delta-1與牙齒再生中成牙本質(zhì)細(xì)胞分化密切相關(guān)，但其對(duì)DPSC影響的機(jī)制研究甚少，本研究利用基因工程技術(shù)克隆Notch配體Delta-1結(jié)構(gòu)基因，構(gòu)建Notch配體Delta-1基因真核表達(dá)載體。

1 材料和儀器

1.1 主要材料 克隆載體pCDNA3.1+，載體抗性Ampicillin，載體長度5.4 kb(上海生工)，pfu高溫DNA聚合酶(北京百川開泰公司)，Taq PCR Master Mix(上海生工)，限制性內(nèi)切酶HindⅢ，BamHI，dNTP ，T4 DNAligase Buffer ，T4 DNAligase(Promega公司)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(上海生工)，geneRuler SM0331 marker(MBI公司)，引物設(shè)計(jì):oiniga基因分析軟件，參照Genbank上公布的Delta-1的基因序列進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)102條引物，引物由上海生工公司合成。

1.2 主要儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)Bioseep Flexi1000(日本奧林巴斯)，紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用)，酶標(biāo)儀BIORAD(美國伯樂)，電子天平BSA-124S(德國 SARTORIUS)，全溫度振蕩培養(yǎng)箱FZQ-F100(江蘇太倉華美儀器公司)，超低溫冰箱MDF-U53(日本三洋)，高壓滅菌鍋 LX-B75-IL(北京華泰)，超凈工作臺(tái)SW-G-2FD(蘇州凈化)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱SKFG-1(上海璽恒)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3.1 目的片段的擴(kuò)增 首先根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，參考Genbank上公布的Delta-1的基因序列Delta-1長度為2 190 bp，Delta-1為102條引物，通過PCR的方法擴(kuò)增出足夠量的目的產(chǎn)物，PCR反應(yīng)采用的是Pfu高溫聚合酶。PCR各個(gè)成分的用量:引物濃度為1 OD溶于400μl ddH2O，Delta-1反應(yīng)體系:50 μl，引物 Mix(0.4×引物條數(shù))12 μl，dNTP 1 μl(25 mmol/L)，10×Pfu 緩沖液 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 32μl，引物 Mix為每條引物5μl的混合液;delta-1分3段:1/32，31/62，61/102。PCR 程序:95℃ 預(yù)變性 3 min，94℃ 變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 個(gè)反應(yīng)循環(huán)。然后以PCR產(chǎn)物為模板，基因的首尾引物作為上下游引物，進(jìn)行第二次擴(kuò)增PCR各個(gè)成分的用量:(引物濃度為1 OD溶于400μl ddH2O)，反應(yīng)體系:50 μl，第一輪 PCR 產(chǎn)物(3 個(gè)片段)各 2 μl，Delta-1P 12 μl，Delta-1 P 102 2 μl，dNTP 1μl(25 mmol/L each)，10×Pfu 緩沖液 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O34 μl。PCR 程序:95℃ 預(yù)變性 3 min，94℃ 變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 個(gè)反應(yīng)循環(huán)。

1．3.2 PCR產(chǎn)物與載體pCDNA3.1+酶切回收 在PCR產(chǎn)物中加入其兩倍體積的上樣緩沖液，即80μl。然后轉(zhuǎn)入2 ml帶柱子的收集管中，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。加上樣緩沖液300μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液，此時(shí) DNA已經(jīng)掛在柱子上。加 Wash Solution 700μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。重復(fù)上述步驟，此時(shí)已把DNA以外的雜質(zhì)洗脫完畢，將柱子裝入1.5μl的EP管中，加50 μl，60℃的水洗脫 DNA，13 000 r/min，離心。酶切體系:50μl，delta-1 PCR產(chǎn)物酶切體系:Delta-1 PCR產(chǎn)物20μl，BamH Ⅰ 1 μl(10 U/μl)，HindⅢ1 μl(10 U/μl)，10 倍緩沖液BamHⅠ5μl，ddH2O 23μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 h。載體的酶切體系:pCDNA3.1+1.5μg，BamH Ⅰ 1μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10 倍緩沖液 BamH Ⅰ10μl，ddH2O補(bǔ)足至50μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 h，將所需目的片段切膠回收備用。

1.3.3 目的片段與載體連接 將回收純化好的目的DNA片段和載體，進(jìn)行連接，Delta-1目的片段與載體連接體系:20μl，酶切目的片段 8 μl(50 ng)，酶切載體5 μl(100 ng)，10×T4，DNAligase緩沖液 2 μl，T4 DNAligase 1 μl(5 U/μl)，ddH2O 補(bǔ)充至20μl，上述連接混合液16℃水浴2 h即可。

1.3.4 轉(zhuǎn)化、篩選克隆 通過轉(zhuǎn)化將載體DNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)菌繼而得到含有目的DNA插入的轉(zhuǎn)化菌株是構(gòu)建質(zhì)粒最為關(guān)鍵的一步，本次實(shí)驗(yàn)選擇的感受態(tài)細(xì)菌是DH5α，取一試管感受態(tài)細(xì)菌DH5α置于冰上進(jìn)行融化，溶化后取100μl的菌液。將上述連接液轉(zhuǎn)入DH5α菌液中，輕輕搖動(dòng)試管以便混勻混合物，冰浴30 min，然后42℃中水浴90 s，冰浴3 min，此過程切勿搖動(dòng)試管，向離心管中加入500μl的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃置于搖床上45 min，取已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌DH5α置于LB固定培養(yǎng)基，檢測篩選出陽性克隆進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物純化結(jié)果 按照Genbank的Delta-1目的片段的相關(guān)信息，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增出Delta-1目的片段的基因片斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.9%瓊脂糖凝膠電泳，純化，長度為2 190 bp(圖1)。實(shí)驗(yàn)所用的Marker是MBI公司的SM0331(圖2)，Delta-1目的片段序列見圖3。

圖1 MBI公司的SM0331

圖2 Delta-1 PCR產(chǎn)物純化，長度為2 190 bp

圖3 Delta-1的基因序列

2.2 PCR產(chǎn)物與載體pCDNA3.1+酶切結(jié)果 通過PCR產(chǎn)物與載體pCDNA3.1+酶切結(jié)果來看，PCR擴(kuò)增出Delta-1目的片段長度為2 190 bp，pCDNA3.1+酶切后的長度為5.4 kb，長度符合要求，酶切電泳圖，見圖4、圖5。

2.3 Delta-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建的酶切圖 重組質(zhì)粒pCDNA3.1+-Delta-1提取純化后的酶切圖譜顯示，pCDNA3.1的長度為5.4 kb，Delta-1的長度為2 190 bp，已經(jīng)成功地構(gòu)建了質(zhì)粒，見圖6。

圖4 Delta-1酶切電泳圖

圖5 PCDNA3.1+酶切電泳圖

圖6 成功構(gòu)建的p CDNA3.1+-Delta-1質(zhì)粒酶切圖

3 討論

臨床上由于牙體缺損或牙列缺損是人類健康所面臨的主要危害之一，最大限度恢復(fù)患者的口腔生理咀嚼狀態(tài)和功能已成為口腔臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)，組織工程再生牙齒的研究常以干細(xì)胞、生物支架及信號(hào)分子為基礎(chǔ)。2000年Gronthos等〔3〕體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過分離的人牙髓細(xì)胞具有克隆形成能力、高增殖率，命名為DPSC，其后許多學(xué)者利用DPSC在大鼠和家兔體內(nèi)、體外進(jìn)行了相關(guān)研究，均成功形成反應(yīng)性牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究牙齒的再生的可能性提供了強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Notch配體Delta-1信號(hào)途徑，作為細(xì)胞間相互作用的一種主要通路，是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化重要的信號(hào)途徑之一，但其對(duì)DPSC影響如何研究甚少。對(duì)牙髓的再生研究中，Spath等〔4〕發(fā)現(xiàn)Delta-1表達(dá)增強(qiáng)在牙髓受刺激形成修復(fù)性牙本質(zhì)過程及DPSC研究中具有重要意義，DPSC可作為Delta-1基因的受體細(xì)胞，與納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合后具有成牙本質(zhì)能力。而且發(fā)現(xiàn)Delta-1信號(hào)與骨形成蛋白之間可能存在相互作用，但Delta-1基因和骨形成蛋白協(xié)同作用DPSC形成牙本質(zhì)能力的機(jī)理未完全闡述清楚。國內(nèi)何飛的研究中發(fā)現(xiàn)初步顯示Delta1轉(zhuǎn)染DPSC具有較單純DPSC更強(qiáng)的牙本質(zhì)形成能力，表明Delta1可對(duì)DPSC作為組織工程種子細(xì)胞起到基因強(qiáng)化的效果，為進(jìn)一步的組織工程牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合物相關(guān)研究奠定新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)〔5〕。

因此，對(duì)DPSC等種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，促使其定向分化為牙齒組織甚至組織工程牙齒，就具有重要的理論意義和迫切的實(shí)踐意義，本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中成功分離鑒定出人DPSC的基礎(chǔ)上，進(jìn)行構(gòu)建pCDNA3.1+-Delta-1質(zhì)粒的相關(guān)研究，以便對(duì)下一步的DPSC的增值和分化的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。pCDNA3.1是由pCDNA3衍生而來的大小約5.4 kb的DNA序列，可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度穩(wěn)定的短暫表達(dá)，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)都可以穩(wěn)定的非復(fù)制性的表達(dá)。由于pCDNA可以保證目的基因的高水平穩(wěn)定的表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)利用其作為載體來進(jìn)行pCDNA3.1+-Delta-1質(zhì)粒的研究，發(fā)現(xiàn)合成的質(zhì)粒穩(wěn)定，酶切圖譜清晰，且方便目的基因的篩選及復(fù)制，對(duì)細(xì)胞染色體不產(chǎn)生副作用，是一種方便有效的質(zhì)粒合成載體。

綜上所述，本課題通過將Delta-1基因與PCDNA3.1構(gòu)建成真核表達(dá)載體，經(jīng)過生物軟件測序及Genebank的分析等鑒定，證實(shí)成功獲得pCDNA3.1+-Delta-1質(zhì)粒，本課題組將在隨后的研究中，對(duì)DPSC的增殖和分化進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為牙齒的再生研究將奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Lovschall H，Tummers M，Thesleff I，et al．Activiation of the Notch signaling pathway in response to pulp capping of rat molars〔J〕．Eur J Oral Sci，2005;113(4):312-7.

2 Lovschall H，Mitsiadis TA，Poulsen K，et al．Coexpression of Notch3 and Rgs5 in the pericyte-vascular smooth muscle cell axis in response to pulp injury〔J〕．Int JDev Biol，2007;51(8):715-21.

3 Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al．Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(25):13625-30.

4 Spath L，Rotilio V，Alessandrini M，et al．Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials〔J〕．Cell Mol Med J，2010;14(6B):1635-44.

5 何 飛，楊崢嶸，譚穎徽，等.Delta1基因轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞牙本質(zhì)形成能力的研究〔J〕．中國修復(fù)重建外科雜志，2007;21(10):1133-6.