動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Treg細(xì)胞比例及功能變化

張美杰 李 穎 么曉軼 李桂玲 金 迪 張繼榮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是腦梗死最重要的病理基礎(chǔ)，而炎癥是導(dǎo)致AS發(fā)生的重要原因〔1，2〕。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一種具有免疫抑制功能的細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫平衡中具有重要的作用。Treg細(xì)胞比例降低或功能喪失都將導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡受到破壞，從而出現(xiàn)免疫炎性反應(yīng)。Mallat等〔3〕認(rèn)為，Treg可控制AS的發(fā)生和發(fā)展。目前關(guān)于Treg細(xì)胞在AS性腦梗死發(fā)病中的研究還很少。本研究擬探討AS性腦梗死患者外周血Treg比例及功能的變化情況。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年5月1日至2014年7月1日在我科住院的AS性腦梗死患者20例為研究組，選擇同期入院進(jìn)行健康體檢者20例為對(duì)照組。研究組男11例，女9例;平均年齡(56.73±6.35)歲，均排除自身免疫性疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全和血液系統(tǒng)疾病等。對(duì)照組男10例，女10例;平均年齡(56.36±6.39)歲。AS性腦梗死患者根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分(輕度:≤15分;中度:16～30分;重度:31～45分)。根據(jù)Pullicino公式(長(zhǎng)×寬×CT或MRI掃描陽(yáng)性層數(shù)/2)計(jì)數(shù)梗死灶體積(小梗死灶:＜5 cm3;中梗死灶:5～10 cm3;大梗死灶:＞10 cm3)。

1.2 主要試劑 Ficoll分離試劑購(gòu)自GE Healthcare公司;APC-Foxp3購(gòu)自Biolegend公司;Treg細(xì)胞和Na?ve CD4 T細(xì)胞分選磁珠購(gòu)自美天旎公司;CFSE試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法 所有患者于入院后次日清晨空腹采集外周靜脈血，經(jīng)Ficoll分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，具體分離方法參見(jiàn)文獻(xiàn)〔4〕。

1.4 Treg細(xì)胞和Na?ve CD4 T細(xì)胞獲取方法 嚴(yán)格按照美天旎磁珠分選說(shuō)明書分選獲取Treg細(xì)胞和Na?ve CD4 T細(xì)胞。

1.5 CFSE增殖檢測(cè) 無(wú)菌分選獲取的Na?ve CD4 T細(xì)胞，以10 ml的 RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，隨后加入終濃度為5 mmol/L的CFSE染液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，隨后在細(xì)胞中加入5 ml預(yù)冷的CFSE染色終止液(含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)，冰上放置5 min，400 r/min離心8 min，再以10 ml的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，細(xì)胞以RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸后，加入預(yù)先包被1μg/ml CD3抗體及2μg/mlCD 28抗體的48孔板中，孵育5 d后收取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行Anova分析方法或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Treg細(xì)胞比例比較 對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞比例為(11.38±2.54)%，明顯低于研究組〔(4.89±0.89)%〕(P＜0.01)。

2.2 研究組外周血Treg細(xì)胞與患者危險(xiǎn)因素關(guān)系 研究組外周血Treg細(xì)胞比例與患者年齡、性別、高血壓、糖尿病和血脂異常均無(wú)明顯關(guān)系(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 研究組外周血Treg細(xì)胞與患者危險(xiǎn)因素關(guān)系(±s)

表1 研究組外周血Treg細(xì)胞與患者危險(xiǎn)因素關(guān)系(±s)

參數(shù) n Treg細(xì)胞比例(%) P值＜65 12 4.87±1.19 ＞0.05≥65 8 4.39±1.13性別 男 10 4.55±1.22 ＞0.05女10 4.21±1.14高血壓 是 12 4.45±1.01 ＞0.05否8 4.65±1.25糖尿病 是 11 4.45±1.01 ＞0.05否9 4.11±1.73血脂異常 是 11 4.45±1.81 ＞0.05否年齡(歲)9 4.01±1.24

2.3 研究組外周血Treg細(xì)胞比例與患者病情相關(guān)性分析輕、失重度神經(jīng)功能缺損患者外周血Treg細(xì)胞比例分別為(7.45±3.52)%、(4.22±1.36)%、(2.18±1.20)%，隨著神經(jīng)功能缺損逐漸加重，患者外周血Treg細(xì)胞比例逐漸降低。小、中、大梗死灶患者外周血Treg細(xì)胞比例分別為(6.45±2.47)%、(4.15±1.79)%、(2.46±1.16)%，隨著梗死灶體積的逐漸加大，患者外周血Treg細(xì)胞比例逐漸降低。

2.4 外周血Treg細(xì)胞抑制CD4 T細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 對(duì)照組外周血單獨(dú)Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(81.3±10.56)%，Na?ve CD4 T細(xì)胞與Treg細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(52.2±11.39)%。研究組外周血單獨(dú)Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(82.2±13.45)%，Na?ve CD4 T細(xì)胞與Treg細(xì)胞共培養(yǎng)后，Na?ve CD4 T細(xì)胞的增殖能力為(81.9±11.48)%。與對(duì)照相比，研究組外周血Treg細(xì)胞抑制外周血Na?ve CD4 T細(xì)胞增殖的能力顯著降低(P＜0.01)。

3 討論

AS是動(dòng)脈硬化血管病中常見(jiàn)的最重要的一種，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開(kāi)始。AS患者動(dòng)脈壁上會(huì)沉積一層像小米粥樣的脂類，使動(dòng)脈彈性減低、管腔變窄。AS發(fā)病過(guò)程一般是先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，伴隨有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動(dòng)脈，逐漸發(fā)展到阻塞動(dòng)脈腔，則導(dǎo)致該動(dòng)脈供應(yīng)的組織或器官缺血或壞死。目前關(guān)于AS的發(fā)病機(jī)制主要有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、炎癥損害學(xué)說(shuō)和內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)等〔5～7〕，然而在這些學(xué)說(shuō)中相似的是都認(rèn)為炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程具有重要作用〔8，9〕。

Treg是一種具有免疫抑制功能的細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫平衡中具有重要的作用。已知Treg細(xì)胞比例降低或功能喪失都將導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡受到破壞，從而出現(xiàn)免疫炎性反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，已成為當(dāng)今治療動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的重要靶點(diǎn)〔10〕。國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，Treg細(xì)胞在急性心肌梗死后其外周血數(shù)量明顯減少〔11〕。而目前關(guān)于Treg細(xì)胞在AS性腦梗死患者外周血中的變化研究還很少。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS性腦梗死患者外周血Treg細(xì)胞比例顯著降低，其外周血Treg細(xì)胞比例與患者發(fā)病危險(xiǎn)因素均無(wú)明顯關(guān)系，而與患者神經(jīng)功能缺損評(píng)分和梗死灶體積明顯相關(guān)，隨著神經(jīng)功能缺損的逐漸加重和梗死灶體積的逐漸加大，外周血Treg細(xì)胞比例逐漸降低。提示AS性腦梗死患者外周血Treg細(xì)胞免疫抑制功能受損。綜述所述，本研究結(jié)果證實(shí)AS性腦梗死患者外周血Treg細(xì)胞比例明顯降低，功能也出現(xiàn)一定程度的喪失，導(dǎo)致免疫炎性反應(yīng)發(fā)生，最終導(dǎo)致AS性腦梗死發(fā)病。

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