大鼠左全肺切除促進肺血管重塑

許果，趙興吉，向小勇，王繼相，佘凱

(1.四川綿陽四0四醫(yī)院胸心外科，四川 綿陽 621000;2.重慶市急救醫(yī)療中心胸心外科，重慶 400014;3.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶 400016)

肺切除是臨床上治療肺部疾病的一種重要手段，隨著肺癌和肺結(jié)核發(fā)病率的增加，以及治療手段的進步，全肺切除的比例有所增加［1，2］?，F(xiàn)有關(guān)全肺切除的研究主要是圍手術(shù)期處理，對術(shù)后遠期療效的評價缺乏病理學依據(jù)。本實驗通過切除大鼠左全肺建立動物模型，以模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變，了解遠期是否發(fā)生肺血管重塑和肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，探討肺血管重塑可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性 SD大鼠24只，2～3月齡，體重(248±26)g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心［SCXK(渝)2007－0001］。實驗場地由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供［SYXK(渝)2007－0001］。隨機分為2組:實驗組12只，行左全肺切除;對照組12只，行假手術(shù)。術(shù)后飼養(yǎng)l2周。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，行氣管切開，置入自制氣管導管，接小動物呼吸機。沿左胸第五肋間進入胸腔，切除左全肺。對照組麻醉同前，切口至壁層胸膜后，保持其完整，不入胸腔，縫合切口。

1.2.2 肺動脈壓力測定

采用右心導管法測定平均肺動脈壓(mPAP)。

1.2.3 動脈血氧分壓(PaO2)測定

從左心室抽血，用于測定PaO2。

1.2.4 電鏡標本制備及觀察

切除右肺，從外周部位及肺門水平切取2～3塊1～2 mm組織塊，處理后在電鏡下觀察肺腺泡內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的大小、形態(tài)、排列形式、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、表型的轉(zhuǎn)化等。

1.2.5 光鏡標本制備及觀察

肺組織標本用4%中性甲醛固定，用石蠟包埋，沿右肺門橫斷取材，分別作HE及免疫組化染色。

(1)三型肺小血管不同肌化程度百分比的測定:在400倍光鏡下，觀察并計數(shù)肺小血管(15 μm＜直徑≤200 μm)中肌型動脈(muscularized artery，MA)、部分肌型動脈(partially muscularized artery，PMA)及非肌型動脈(non－muscularized artery，NMA)的數(shù)目，分別計算它們各占肺小血管總數(shù)的百分比，反映肺小血管的肌化程度。每例標本觀測10個血管。

(2)肺中、小型動脈相對中膜厚度及面積的測定:應用Mias圖像分析系統(tǒng)測取動脈外徑、中膜厚度(media thickness of vessel，MTV)、血管總面積及中膜面積(media area of vessel，MAV)，分別計算中膜厚度與動脈外徑的比值(MTV%)，中膜面積與血管總面積的比值(MAV%)，作為肺血管重塑的指標。每只大鼠各測量10個肺中型動脈(100 μm ＜直徑≤200 μm)和肺小型動脈(15 μm ＜直徑≤100 μm)上述各值，并求其均值。

1.2.6 肺組織免疫組織化學染色SABC法

操作按試劑盒說明進行。

1.2.7 圖像分析

對免疫組織化學染色強度進行測量，每張切片均測量其背景灰度，以消除切片間的誤差。用Image－Pro Plus圖像分析系統(tǒng)心肺血管分析軟件測取所選血管管壁陽性染色積分光密度(integrated optical density，IOD)作為肺動脈管壁 VEGF和 HIF－1α的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，統(tǒng)計方法采用獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，Pearson檢驗進行直線相關(guān)分析。檢驗水準α =0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 平均肺動脈壓與動脈血氧分壓的比較

實驗組mPAP(31.91±1.98 mmHg)明顯高于對照組(17.82±1.94 mmHg)，PaO2(77.46±5.36 mmHg)明顯低于對照組(90.39±6.02 mmHg)，(P＜0.01)。

2.2 三型肺小血管不同肌化程度百分比的比較

實驗組肺小血管中MA%和PMA%(22.50±4.52，23.33±4.92)明顯高于對照組(13.33±4.92，14.17±5.15)(P＜0.01)，NMA%(54.17±5.15)明顯低于對照組(72.50±7.54)(P＜0.01)。

2.3 肺小血管結(jié)構(gòu)改變

HE染色顯示對照組的肺小血管管壁較薄，內(nèi)膜光滑，管腔較大，平滑肌細胞走行一致(圖1)。而實驗組肺小血管收縮，管壁增厚，管腔狹窄、肺血管平滑肌細胞異常增殖(圖2)。圖像分析表明，實驗組大鼠肺中、小型動脈 MTV、MAV、MTV%和MAV%明顯高于對照組(P＜0.01)(表1、2)。

2.4 肺腺泡內(nèi)動脈超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡觀察到對照組肺動脈內(nèi)皮細胞胞體扁平，細胞器結(jié)構(gòu)正常。實驗組肺動脈內(nèi)皮細胞體積增大，基底變窄，呈柱狀突入管腔，細胞器豐富，甚至見內(nèi)皮細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量空泡形成。對照組中膜平滑肌細胞胞體小，平滑肌細胞呈收縮表型。實驗組中膜平滑肌細胞數(shù)量增多，胞體肥大，細胞器增多，不同程度向合成表型轉(zhuǎn)化。平滑肌細胞間及肺間質(zhì)見膠原纖維密集，細胞外基質(zhì)增多(圖3～5)。

2.5 肺小血管壁VEGF與HIF-1α的表達

經(jīng)灰度掃描，實驗組肺動脈壁VEGF及HIF－1α的IOD值(42.04±3.79，26.47±4.16)明顯高于對照組(11.53±2.29，6.12±2.14)(P ＜0.01)。相關(guān)分析表明，VEGF及 HIF－1α陽性染色強度與 PaO2呈負相關(guān)(r= －0.734，r= －0.712)(P ＜0.01)，與肺小動脈MTV%(r=0.672，r=0.657)(P＜0.05)及MAV%(r=0.718，r=0.684)(P ＜ 0.01，P ＜0.05)呈正相關(guān)，HIF－1α與VEGF的陽性染色強度呈正相關(guān)(r=0.627)(P＜0.05)。

表1 實驗組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

表1 實驗組和對照組大鼠肺中動脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

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表2 實驗組和對照組大鼠肺小動脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

表2 實驗組和對照組大鼠肺小動脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

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3 討論

3.1 PH動物模型的建立及評價

導致PH的病因復雜多樣，既往許多學者用多種動物和不同的方法建立過PH動物模型，以模擬不同的發(fā)病因素。如利用大動物建立體－肺分流［3－5］，經(jīng)頸部動靜脈血管吻合，用探針穿破主動脈－下腔靜脈［6］，給大鼠注射野百合堿(monocrotaline，MCT)，導致肺血管內(nèi)皮損傷，從而形成 PH［7］，以及降低氧濃度來誘發(fā)PH［8］等。這些模型都存在不同的局限性，并且不能模擬外科全肺切除后病人的病理生理改變。

圖1 對照組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.1 A small pulmonary artery of a control rat.HE staining，×100

圖2 實驗組大鼠肺小動脈(HE染色×100)Fig.2 A small pulmonary artery of an experimental rat.HE staining，×100

圖3 對照組:肺血管內(nèi)皮細胞胞體扁平，結(jié)構(gòu)正常(×8000)Fig.3 Control group:endothelial cells of the pulmonary artery are flat，the structures are normal. ×8000

圖4 實驗組:肺腺泡內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞呈高柱狀，突入管腔(×8000)Fig.4 Experimental group:endothelial cells of an intra－alveolar pulmonary artery are cubic. ×8000

圖5 實驗組:間質(zhì)膠原纖維堆積(×5000)Fig.5 Experimental group:increase of interstitial collagen fibers.×5000

我們采取左全肺切除方法建立的動物模型，術(shù)后12周測得mPAP明顯升高，表明PH動物模型建立成功。光鏡和電鏡檢查下的病理改變導致肺血管橫截面積顯著增加，肺循環(huán)阻力持續(xù)升高，與文獻報道的肺動脈高壓組織學改變是一致的，表明實驗動脈發(fā)生了肺血管重塑，導致PH行成。

在該模型中，除行肺切除外，未施加其他干預措施，觀察時間較長，能較準確地模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變。由于大鼠體積小、價格低廉，該方法手術(shù)操作簡單，不需吻合血管，單人肉眼即可完成，也不需要顯微鏡等特殊器械，避免了許多精細復雜的操作和吻合口出血、梗阻、狹窄等主要并發(fā)癥，手術(shù)過程相對簡單，動物存活率高，實驗重復性好。因此，本模型在PH的研究中有應用價值，為進一步研究肺血管重塑和PH的發(fā)病機制進而探索干預途徑提供了實驗平臺。

3.2 HIF-1α與VEGF在肺血管重建中的作用

HIF－l是一種轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個蛋白亞基組成，HIF－1α多肽鏈是惟一的氧調(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF－1的活性。HIF－1α是細胞最早感受缺氧刺激的因子之一。常氧條件下HIF－1無DNA結(jié)合活性，而在低氧條件下其表達顯著升高［9，10］。本研究中檢測到實驗組大鼠存在慢性低氧血癥，在其肺動脈內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞和支氣管內(nèi)皮細胞等處有明顯的HIF－1α免疫陽性表達。說明由于大鼠左肺切除導致的低氧血癥刺激誘導了肺內(nèi)HIF－1α表達增加。HIF－1α可誘導大量與低氧應答有關(guān)的下游目的基因的表達，如 VEGF、EPO、iNOS 等［11，12］。在這些細胞因子作用下，血管平滑肌細胞(PASMC)大量增殖，使血管中膜增厚和非肌性血管肌化，血管腔變窄，同時PASMC合成分泌的細胞外基質(zhì)增多，使肺血管彈性回縮力和順應性降低，血流阻力增加，促進PH形成［13，14］。這與本研究中觀察到的病理改變是一致的。

VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，肺是體內(nèi)VEGF最大的來源。VEGF的主要生物學功能是與血管內(nèi)皮細胞表面的特異性受體結(jié)合而促進成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的生長，合成和分泌膠原等細胞外基質(zhì)［15］。近年還發(fā)現(xiàn)其增強血管尤其是微小血管的滲透性，使纖維蛋白原等大分子血漿蛋白外滲沉積在血管外的基質(zhì)中。

VEGF基因表達受多種細胞因子調(diào)控，其中低氧導致的VEGF表達主要是通過HIF－1實現(xiàn)的［16］。在低氧情況下，HIF－1增加了VEGF的轉(zhuǎn)錄、表達和VEGF mRNA的穩(wěn)定性。低氧刺激還引起血管內(nèi)皮細胞膜上與VEGF結(jié)合的受體表達明顯增多，從而增加VEGF的生物效應［17］。在本研究中可見到低氧條件下EVGF在實驗組大鼠肺動脈壁、肺間質(zhì)等處明顯的免疫陽性表達。而重要的是，HIF－1α與VEGF的陽性表達呈正相關(guān)。

結(jié)合本研究我們發(fā)現(xiàn)，低氧血癥是大鼠左全肺切除后肺血管重建的重要因素。當?shù)脱醮碳ねㄟ^血流到達血管壁時，引起血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的分泌功能和細胞骨架的改變，誘導合成和分泌HIF－1α 及VEGF 增加，通過 HIF－1α－VEGF 途徑參與了低氧性肺血管重建過程。

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