表皮葡萄球菌YycG單克隆抗體抗生物膜活性的研究

龔婷，韓海燕，呂智慧，王小飛，曹鋆，程訓(xùn)佳，吳旸，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部／衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

表皮葡萄球菌YycG單克隆抗體抗生物膜活性的研究

龔婷，韓海燕，呂智慧，王小飛，曹鋆，程訓(xùn)佳，吳旸，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部／衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

YycFG雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控葡萄球菌細(xì)胞壁合成、代謝及生物膜形成，PAS是組氨酸激酶YycG的胞外信號感應(yīng)區(qū)域。本研究針對胞外PAS區(qū)域制備抗YycG-PAS單克隆抗體（YycG-PAS MAb）。免疫鑒定結(jié)果表明，YycG-PAS MAb可與重組YycG-PAS蛋白和表皮葡萄球菌菌體YycG蛋白結(jié)合，屬于IgG2a亞型，效價為log 215。YycG-PAS MAb（80μg／ml）與表皮葡萄球菌RP62A菌株共培養(yǎng)24 h，對細(xì)菌生物膜形成的抑制率達(dá)46.5%，與mIgG（80μg／mL）組相比有顯著差異（P＜0.05）。YycG-PAS MAb（80 μg／ml）與低濃度萬古霉素（1μg／ml）聯(lián)用可增強(qiáng)對24 h細(xì)菌生物膜的抑制作用，抑制率由57.6%提高至93.0%（P＜0.01）。YycG-PAS MAb對浮游狀態(tài)表皮葡萄球菌的生長及存活無顯著影響。本研究為YycGPAS MAb在抗生物膜感染中的潛在應(yīng)用價值奠定了一定基礎(chǔ)。

表皮葡萄球菌；生物膜；YycG組氨酸激酶；PAS區(qū)域；單克隆抗體

表皮葡萄球菌是寄居于人體皮膚及呼吸道入口黏膜表面的正常菌群，通常不致?。?］。但隨著植入性醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用，表皮葡萄球菌成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一［2，3］。細(xì)菌在生物膜形成后，對抗生素的敏感性降低，并能逃避人體免疫系統(tǒng)的清除［4－6］，可導(dǎo)致持續(xù)性感染，目前尚無有效藥物和疫苗治療以預(yù)防生物膜疾?。?］。

YycFG雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可調(diào)控葡萄球菌的生長和生物膜形成［8］，存在于GC含量較低的革蘭陽性菌中。哺乳類動物中無相應(yīng)的同源蛋白。YycG為組氨酸激酶，其胞外的PAS功能域可感受外界環(huán)境信號［9］，傳遞至胞內(nèi)組氨酸激酶，使其磷酸化，從而磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控下游基因表達(dá)［10］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，針對YycG胞內(nèi)激酶活性區(qū)的小分子具有抑制生物膜的活性［11］。阻斷YycG胞外信號感受區(qū)是否影響細(xì)菌生物膜的形成？本課題組通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)YycG的胞外PAS區(qū)域在葡萄球菌中保守，具有高度同源性；且PAS區(qū)域?yàn)橛H水蛋白，有利于抗體結(jié)合。為此，本研究制備了針對表皮葡萄球菌YycG胞外PAS區(qū)域的單克隆抗體（簡稱單抗），研究其對表皮葡萄球菌RP62A菌株生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984（SERP62A，生物膜陽性）購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α購自天根生化科技有限公司，大腸埃希菌BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pET28a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑小鼠IgG購自Abmart公司，羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）購自Santa Cruz公司，羊抗鼠IgG1-HRP及 IgG2a-HRP購自Abcam公司，限制性內(nèi)切酶（FD series，1 u／μl）、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自Fermentas公司，RNA抽提試劑盒及Ni-NTA蛋白質(zhì)純化填料購自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）底物購自Thermo公司，基因組和質(zhì)粒抽提試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒、DNA Marker等購自天根生物科技有限公司，異丙基-β－D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）購自美國Merk公司。引物合成及DNA測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫公布的表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株RP62A基因組序列（GenBank accession number：NC＿009276），利用Beacon designer 8及Oligo 7進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，以擴(kuò)增YycG胞外PAS信號感應(yīng)域。上游引物為：5′-CATGCCATGGGCACGAATAGTTTAGAAAAGGAA-3′，酶切位點(diǎn)為NcoⅠ；下游引物為：5′-CCGCTCGAGCTGATTAATGTTGTTCAGCTG-3′，酶切位點(diǎn)為XhoⅠ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 抗YycG-PAS單抗的制備Amart公司根據(jù)本研究提供的PAS氨基酸序列，制備了抗YycGPAS單抗，生產(chǎn)并純化，抗體濃度為5 mg／ml。

1.2.2 重組YycG-PAS蛋白的表達(dá)及純化以RP62A基因組為模板，PCR擴(kuò)增yycG胞外信號感應(yīng)區(qū)域pas片段，與pET28a質(zhì)粒連接，命名為pET28a-pas。將含有pET28a-pas質(zhì)粒的BL21菌液接種于卡那霉素（50μg／ml）抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液600 nm處光密度（optical density，OD）值為0.6，用0.5 mmol／L IPTG25℃誘導(dǎo)12～16 h。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析表達(dá)的蛋白。取超聲裂解菌體的上清液，經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，通過SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色分析重組YycG-PAS蛋白的純度。

1.2.3 抗YycG-PAS單抗效價和IgG亞型的鑒定

將純化的重組YycG-PAS蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg／ml，100μl／孔，4℃包被96孔板過夜。將抗YycG-PAS單抗1∶100稀釋后，進(jìn)行2倍系列稀釋，37℃孵育1 h；以羊抗鼠IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，37℃孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測OD450。以牛血清白蛋白為陰性對照，單抗OD450≥2倍陰性對照OD450的最高稀釋倍數(shù)為抗體效價。以羊抗鼠IgG1-HRP或IgG2a-HRP（1∶2 000）為二抗，檢測抗YycG-PAS單抗的IgG亞型。

1.2.4 抗YycG-PAS單抗的特異性檢測利用蛋白免疫印跡法檢測單抗與重組YycG-PAS蛋白及RP62A菌株YycG蛋白的特異性結(jié)合。超聲裂解，離心收集10 h和12 h的細(xì)菌，離心收集上清液，經(jīng)12%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。以抗YycG-PAS單抗（10 μg／ml）為一抗、羊抗鼠IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，作用后ECL顯色并觀察。

1.2.5 不同生長階段表皮葡萄球菌中YycG表達(dá)的檢測將37℃過夜培養(yǎng)的RP62A菌液按1∶200接種于TSB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，分別于4、6、8、10和12 h取菌液，提取蛋白，方法同上。將提取的菌體蛋白加樣于點(diǎn)雜交儀中（100μl／孔）的硝酸纖維素膜，室溫干燥。5%脫脂奶粉室溫封閉后，以抗YycG-PAS單抗（10μg／ml）、羊抗鼠IgG-HRP（1∶2 000）作用，加入四甲基聯(lián)苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）顯色液顯色。以小鼠IgG（mouse IgG，mIgG；10μg／ml）為陰性對照。

1.2.6 抗YycG-PAS單抗對浮游狀態(tài)表皮葡萄球菌生長和存活的影響將37℃過夜培養(yǎng)的RP62A菌液按1∶200接種于含160μg／ml抗YycG-PAS單抗的TSB培養(yǎng)基中，4℃孵育2 h，37℃振蕩培養(yǎng)，每小時測定一次菌液OD600值，連續(xù)檢測11 h。以160μg／ml mIgG處理的菌液及未經(jīng)處理的菌液為對照。取6 h及24 h培養(yǎng)物進(jìn)行菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 抗YycG-PAS單抗對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響將過夜培養(yǎng)的RP62A菌液（3μl）分別接種于含有單抗或單抗加萬古霉素的TSB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)種至96孔板（200μl／孔），4℃共孵育2 h，37℃靜置培養(yǎng)24 h。結(jié)晶紫染色，干燥后測定紫外吸光度A570［12］。實(shí)驗(yàn)分組包括抗YycG-PAS單抗（80μg／ml）、抗YycG-PAS單抗（80μg／ml）＋萬古霉素（1μg／ml）、萬古霉素（1μg／ml）、mIgG（80μg／ml）及未經(jīng)處理組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 重組YycG-PAS蛋白的原核表達(dá)與純化

為鑒定抗YycG-PAS單抗，本研究構(gòu)建了重組YycG-PAS蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。以RP62A的DNA為模板，PCR擴(kuò)增yycG胞外感應(yīng)區(qū)pas的基因片段（100～552 bp），PCR產(chǎn)物為453 bp。擴(kuò)增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶XholⅠ及NcoⅠ酶切后與pET28a質(zhì)粒連接，經(jīng)酶切鑒定及測序確認(rèn)，命名為pET28a-pas（圖1）。在IPTG誘導(dǎo)下，重組YycGPAS蛋白存在于上清液中，相對分子質(zhì)量約為18 000（圖2）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，抗YycGPAS單抗可與重組YycG-PAS蛋白結(jié)合（圖3B）。

圖1 pas的PCR擴(kuò)增及pET28a-pas重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of pas and identification of pET28a-pas plasmid

圖2 重組YycG-PAS蛋白的表達(dá)及純化Fig.2 Expression and purification of recombinant YycG-PAS protein

圖3 不同生長階段表皮葡萄球菌中YycG蛋白的表達(dá)量Fig.3 Detection of YycG expression in RP62A strain using YycG-PAS monoclonal antibody

2.2 抗YycG-PAS單抗的效價檢測及亞型鑒定

以重組YycG-PAS蛋白包板，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測抗YycG-PAS單抗（5 mg／ml）的效價為log 215，OD450值為0.229。以牛血清白蛋白為陰性對照，OD450值為0.109，閾值為0.218。用羊抗鼠IgG1及IgG2a抗體為二抗檢測，顯示單抗的IgG亞類為IgG2a。

2.3 不同生長階段表皮葡萄球菌中YycG表達(dá)的檢測

用免疫斑點(diǎn)法檢測RP62A菌株不同生長期（4、6、8、10、12 h）YycG蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，所檢測時間點(diǎn)的細(xì)菌均顯示陽性，12 h達(dá)高峰，而mIgG檢測結(jié)果呈陰性（圖3A）。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)10、12 h表皮葡萄球菌菌體蛋白均可檢測到與抗YycG-PAS單抗反應(yīng)的條帶，相對分子質(zhì)量為70 000（圖3B）。

2.4 抗YycG-PAS單抗對浮游細(xì)菌生長及存活的影響

檢測抗YycG-PAS單抗對浮游RP62A菌株生長及細(xì)菌存活（6、24 h）的影響。結(jié)果顯示，加入抗YycG-PAS單抗（160μg／ml）對RP62A菌株的生長曲線無明顯影響，與mIgG（160μg／ml）處理組和未處理組相似（圖4）。與抗YycG-PAS單抗共培養(yǎng)6 h菌落數(shù)為（6.18±0.38）log CFU／μl，培養(yǎng)24 h菌落數(shù)為（6.37±0.25）log CFU／μl，與mIgG組及未處理組無顯著差異。

圖4 抗YycG-PAS單抗對表皮葡萄球菌RP62A生長曲線的影響Fig.4 Growth curve of S.epidermidis RP62A co-cultured with YycG-PAS monoclonal antibody

2.5 抗YycG-PAS單抗對細(xì)菌生物膜形成的影響

將過夜RP62A接種至抗YycG-PAS單抗（80 μg／ml）中，培養(yǎng)6或24 h。生物膜檢測結(jié)果顯示，抗YycG-PAS單抗組、mIgG（80μg／ml）組和未處理組6 h生物膜OD570值分別為0.424±0.008、0.780±0.04及0.904±0.02；24 h生物膜OD570值分別為1.056±0.08、1.857±0.18及1.973±0.14?？筜ycG-PAS單抗或mIgG對6 h生物膜的抑制率分別為53.1%和13.7%（P＜0.05）；對24 h生物膜的抑制率分別為46.5%和5.9%（P＜0.05）（圖5）。

圖5 抗YycG-PAS單抗對表皮葡萄球菌RP62A生物膜形成的影響Fig.5 Effect of YycG-PAS monoclonal antibody on biofilm formation of S.epidermidis RP62A

進(jìn)一步研究抗YycG-PAS單抗與萬古霉素聯(lián)用對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。將過夜RP62A接種至含有抗YycG-PAS單抗（80μg／ml）和萬古霉素〔1μg／ml，1／4最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）〕的培養(yǎng)基中，24 h后檢測生物膜形成情況。結(jié)果顯示，與未處理組相比，低濃度萬古霉素?zé)o抗生物膜的作用；抗YycGPAS單抗與萬古霉素聯(lián)用具有顯著抑制生物膜形成的作用（P＜0.000 1），而mIgG（80μg／ml）與萬古霉素（1μg／ml）聯(lián)用則無顯著抑制作用（P＞0.05）（表1）。與單用萬古霉素相比，抗YycG-PAS單抗與萬古霉素聯(lián)用對細(xì)菌生物膜形成有顯著抑制作用（P＜0.000 1）；與抗YycG-PAS單抗相比，聯(lián)用萬古霉素對細(xì)菌生物膜形成有顯著抑制作用（P＜0.01）。

表1 抗YycG-PAS單抗與萬古霉素聯(lián)用對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響Tab.1 Effect of YycG-PAS monoclonal antibody in combination with vancomycin on bacterial biofilm formation

3 討論

YycFG雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)高度保守，存在于GC含量較低的革蘭陽性菌，調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、細(xì)胞壁代謝、耐藥及毒力，是研發(fā)抗菌藥物的良好靶點(diǎn)［13］。YycFG雙組分系統(tǒng)感受外界信號的途徑為：組氨酸激酶YycG的膜外配體結(jié)合區(qū)域感受外界環(huán)境的信號，激活激酶，發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而將激酶組氨酸上磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白YycF的天冬氨酸殘基，激活效應(yīng)區(qū)域，暴露DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)控下游基因表達(dá)。YycG為跨膜蛋白，含有膜外PAS信號感應(yīng)區(qū)及膜內(nèi)HATPase＿c等激酶區(qū)域［10］。

YycG的胞外PAS區(qū)域在葡萄球菌中保守，同源度達(dá)87%。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示PAS區(qū)域?yàn)橛H水蛋白，二級結(jié)構(gòu)以β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為主。β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)多突出于蛋白表面，區(qū)域柔性較高，有利于抗體結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到針對YycG胞內(nèi)激酶區(qū)域的抑制劑，能抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成［11］。然而，針對YycG-PAS的單抗能否抑制生物膜的形成？為此，本研究制備了抗YycG-PAS單抗，并用純化的重組YycG-PAS原核表達(dá)蛋白檢測和鑒定，結(jié)果顯示其效價高達(dá)log 215，屬于IgG2a亞型?？筜ycG-PAS單抗能與培養(yǎng)10和12 h的RP62A菌體蛋白結(jié)合，大小約70 000，與預(yù)測的YycG蛋白大小一致。免疫斑點(diǎn)結(jié)果顯示，YycG蛋白在RP62A對數(shù)生長期表達(dá)，12 h達(dá)高峰，與yycGmRNA檢測結(jié)果趨勢一致；而用mIgG為對照，檢測結(jié)果為陰性，提示抗YycG-PAS單抗具有特異性。

YycG在表皮葡萄球菌生物膜的形成中起重要調(diào)控作用［8］。PAS為YycG的胞外信號感應(yīng)區(qū)，可接受外界環(huán)境信號，與YycH及YycI形成三聚體，調(diào)控YycG的激酶活性［14］。本研究顯示，抗YycGPAS單抗與表皮葡萄球菌共培養(yǎng)6及24 h，能抑制細(xì)菌生物膜的形成。推測抗YycG-PAS單抗可能通過結(jié)合PAS區(qū)域阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響YycG對外界信號的磷酸化傳遞過程，從而影響YycFG雙組分系統(tǒng)對生物膜形成的調(diào)控，這有待進(jìn)一步研究。

革蘭陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，厚度達(dá)20～30 nm，可能會阻礙抗Yycg-PAS單抗與PAS結(jié)合，使單抗作用濃度達(dá)較高水平（80～160 μg／ml）。本研究初步探討了抗YycG-PAS單抗與低濃度萬古霉素（細(xì)胞壁肽聚糖抑制劑）聯(lián)用對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。雖然表皮葡萄球菌生物膜能抵抗萬古霉素的抗菌作用［15］，但本研究顯示低濃度萬古霉素（1／4 MIC）可明顯增強(qiáng)抗YycGPAS單抗抑制細(xì)菌生物膜形成的作用。推測低濃度萬古霉素部分抑制細(xì)胞壁合成，從而影響細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，使抗YycG-PAS單抗更易進(jìn)入細(xì)胞壁與胞外PAS區(qū)域結(jié)合，從而阻斷對信號的感應(yīng)。本研究為單抗在抗生物膜感染中的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)，但對抗YycG-PAS單抗作用的B細(xì)胞表位鑒定及其抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ O’Gara JP，Humphreys H.Staphylococcus epidermidisbiofilms：importance and implications［J］.J Med Microbiol，2001，50（7）：582-587.

［2］ Centers for Disease Control and Prevention（CDC）.Vital signs：central line-associated blood stream infections——United States，2001，2008，and 2009［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2011，60（8）：243-248.

［3］ Gomes F，Teixeira P，Oliveira R.Mini－review：Staphylococcus epidermidis as the most frequent cause of nosocomial infections：old and new fighting strategies［J］.Biofouling，2014，30（2）：131-141.

［4］ Claessens J，Roriz M，Merckx R，Baatsen P，Van Mellaert L，Van Eldere J.Inefficacy of vancomycin and teicoplanin in eradicating and killing Staphylococcus epidermidis biofilms in vitro［J］.Int J Antimicrob Agents，2015，45（4）：368-375.

［5］ Mark L，Hanke，Tammy K.Deciphering mechanisms of staphylococcal biofilm evasion of host immunity［J］.Front Cell Infect Microbiol，2012，62（2）：1-12.

［6］ Gil C，Cristina S，Saloa B，Cristina L，Begona G，Alejandro TA，Inigo L，Jaione V.Biofilm matrix exoproteins induce a protective immune response against Staphylococcus aureus biofilm infection［J］.Infect Immun，2014，82（3）：1017-1029.

［7］ Kostakioti M，Hadjifrangiskou M，Hultgren SJ.Bacterial biofilms：development，dispersal，and therapeutic strategies in the dawn of the postantibiotic era［J］.Cold Spring Harb Perspect Med，2013，3（4）：a010306-a010306.

［8］ Dubrac S，Boneca IG，Poupel O，Msadek T.New insights into the WalK／WalR（YycG／YycF）essential signal transduction pathway reveal a major role in controlling cell wall metabolism and biofilm formation in Staphylococcus aureus［J］.J Bacteriol，2007，189（22）：8257－8269.

［9］ Mascher T，Helmann JD，Unden G.Stimulus perception in bacterial signal-transducing histidine kinases［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（4）：910-938.

［10］ West AH，Stock AM.Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（6）：369-376.

［11］ Huang RZ，Zheng LK，Liu HY，Pan B，Hu J，Zhu T，Wang W，Jiang DB，Wu Y，Wu YC，Han SQ，Qu D.Thiazolidione derivatives targeting the histidine kinase YycG are effective against both planktonic and biofilm-associated Staphylococcus epidermidis［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33（3）：418-425.

［12］ Peeters E，Nelis HJ，Coenye T.Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates［J］.J Microbiol Methods，2008，72（2）：157-165.

［13］ Dubrac S，Bisicchia P，Devine KM，Msadek T.A matter of life and death：cell wall homeostasis and the WalKR（YycGF）essential signal transduction pathway［J］.Mol Microbiol，2008，70（6）：1307-1322.

［14］ Szurmant H，Mohan MA，Imus PM，Hoch JA.YycH and YycI interact to regulate the essential YycFG two-component system in Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，2007，189（8）：3280－3289.

［15］ Pinheiro L，Brito CI，Pereira VC，Oliveira Ad，Camargo CH，Cunha Mde L.Reduced susceptibility to vancomycin and biofilm formation in methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis isolated from blood cultures［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2014，109（7）：871-878.

Effect of anti-YycG monoclonal antibody against Staphylococcus epidermidis biofilm formation

GONG Ting，HAN Hai-Yan，LU Zhi-Hui，WANG Xiao-Fei，CAO Yun，CHENG Xun-Jia，WU Yang，QU Di
Department of Microbiology and Parasitology，Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China

Bacterial YycFG two-component signal transduction system plays a major role in controlling cell wall synthesis，metabolism and biofilm formation ofStaphylococcus.The extracellular PAS domain of YycG histidine kinase can sense various environmental signals.Therefore，a monoclonal antibody targeting PAS domain ofStaphylococcus epidermidis（S.epidermidis）was produced（YycG-PAS MAb）.Enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）indicated that YycG-PAS MAb belonged to IgG2a subclass and antibody titer was log 215.Western blotting suggested that YycG-PAS MAb had the ability to bind both recombinant YycG-PAS protein and protein extracted from cells.Further investigation exhibited inhibitory effect of YycG-PAS MAb（80μg／ml）against biofilm formation after co-incubation with S.epidermidis and the inhibitory rate was 46.5%.The anti-biofilm activity of YycG-PAS MAb was improved when combined with low-concentration of vancomycin（1μg／ml）.The inhibitory rate was increased from57.6%to 93.0%（P＜0.01）.No significant effects of YycG-PAS MAb on viability and growth of planktonic bacterial cells were observed.This study indicated that YycG-PAS MAb is a promising candidate antibody for biofilm-related infections.

Staphylococcus epidermidis；Biofilm；YycG histidine kinase；PAS domain；Monoclonal antibody

.QU Di，E-mail：dqu＠fudan.edu.cn

2015-04-20）

國家自然科學(xué)基金（81101214、81271791）

瞿滌