胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究

崔若辰，蔡報(bào)偉，蘇勁紅，胡鑫炎，孫雨涵，郭 權(quán)，周克夫

（廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建廈門361102）

胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究

崔若辰，蔡報(bào)偉，蘇勁紅，胡鑫炎，孫雨涵，郭 權(quán)，周克夫*

（廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建廈門361102）

檢測并分析胸腺素α原（prothymosinα，Pro Tα）在小鼠正常肝組織與肝腫瘤組織中表達(dá)、分布的情況.取20只昆明雄性小鼠隨機(jī)分為對照組和移植性肝癌模型組，每組10只，模型組接種H22肝癌組織，建立移植性肝癌模型.7 d后將模型組肝癌組織和對照組正常肝的組織取出，部分組織按常規(guī)石蠟包埋方法制片，免疫組織化學(xué)法分別檢測肝癌組織與正常肝組織中Pro Tα的表達(dá)分布情況；部分組織按提取胞質(zhì)蛋白的方法獲得蛋白用于Western-blot分析.在Westernblot中，Pro Tα在肝癌組織細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)量明顯低于正常肝組織；在免疫組織化學(xué)法中，正常肝組織的細(xì)胞核呈陰性，胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性；而在肝癌組織中胞核呈強(qiáng)陽性，胞質(zhì)呈弱陽性.Pro Tα在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)分布有明顯差異.由于在Western-blot中所提的蛋白主要為胞質(zhì)蛋白，在癌變的組織中，Pro Tα主要集中在細(xì)胞核中，因此推測，當(dāng)胞質(zhì)中的Pro Tα大量表達(dá)時(shí)對于肝細(xì)胞穩(wěn)定、抑制細(xì)胞發(fā)生癌變有重要功能，此結(jié)果為進(jìn)一步研究Pro Tα在腫瘤發(fā)生和診斷中的作用提供了重要的理論依據(jù).

胸腺素α原；H22細(xì)胞株；肝癌；定位

原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer）簡稱肝癌，是肝臟的惡性腫瘤，也是世界十大惡性腫瘤之一［1］.肝癌起病比較隱匿，早期癥狀不明顯，中期甚至部分晚期患者癥狀仍不明顯，一旦出現(xiàn)比較典型的癥狀，到醫(yī)院就診已多屬晚期，錯(cuò)過最佳治療時(shí)期.根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)［2］，全世界每年新發(fā)肝癌患者約78萬，居惡性腫瘤的第五位，因此，揭示肝腫瘤的癌變機(jī)理以及早期診斷是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn).

胸腺素α原（prothymosinα，Pro Tα）是一種天然無二級結(jié)構(gòu)、強(qiáng)酸性小分子蛋白，其功能與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖［3］、凋亡有著密切關(guān)系.作為一種典型的腫瘤相關(guān)蛋白，在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面的深入研究有助于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞癌變的發(fā)生機(jī)理，曾在多種癌癥中檢測到了Pro Tα水平的升高［4］；這種在癌細(xì)胞中高水平的Pro Tα蛋白產(chǎn)物不僅維持細(xì)胞處于高度增殖狀態(tài)，還保護(hù)細(xì)胞避免進(jìn)入凋亡途徑.體外實(shí)驗(yàn)，在凋亡過程中，Pro Tα被caspase-3切割而發(fā)生斷裂［5］，導(dǎo)致核定位信號遭到破壞，進(jìn)而使斷裂的ProTα從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)和胞外，由于Pro Tα不能在核內(nèi)積聚而削弱了其核內(nèi)與增殖相關(guān)的功能，這種現(xiàn)象并不見于正常細(xì)胞；而且，胞核和胞質(zhì)定位的Pro Tα衍生物對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡［6］均有抵抗作用，所以，研究Pro Tα在癌變過程中的定位有助于揭示細(xì)胞癌變的發(fā)生機(jī)理.目前國內(nèi)外有關(guān)移植性肝癌和正常肝組織中Pro Tα水平和定位的研究還未見報(bào)道.我們應(yīng)用本課題組克隆表達(dá)的重組人Pro Tα［7］制備了多克隆抗體［8］，采用Western-blot和免疫組織化學(xué)的方法對小鼠正常肝組織和腫瘤組織中的Pro Tα進(jìn)行了分析，其結(jié)果將對研究Pro Tα在腫瘤發(fā)生和治療中的作用以及腫瘤臨床醫(yī)學(xué)的診斷預(yù)測有重要價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)動物：SPF級昆明小鼠20只，雄性，質(zhì)量22～30 g，6～8周齡，購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，置于溫度20℃左右，濕度65%左右的室內(nèi)，以普通小鼠飼料喂養(yǎng).

肝癌細(xì)胞株：小鼠H22腹水型肝癌細(xì)胞株由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，SPF級昆明小鼠傳代.

主要試劑：大鼠抗Pro Tα多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制備；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體購自美國聯(lián)科生物產(chǎn)品，UltraSensitiveTMSP試劑盒、DAB試劑盒購自福州邁新公司.

1.2 方 法

1.2.1 H22實(shí)體瘤荷瘤小鼠和移植性肝癌模型制備

無菌條件下將H22腹水腫瘤按1∶8稀釋計(jì)數(shù)，然后調(diào)整濃度為3×107m L￣1，以100μL/只接種，其細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)/只，接于小鼠的前肢腋下，觀察生長情況.當(dāng)腫瘤長至0.5 cm時(shí)，無菌條件下取出腫瘤組織.將組織切細(xì)后用手術(shù)方法將組織移植到小鼠肝組織中，傷口用醫(yī)用生物膠封閉.腫瘤小鼠模型養(yǎng)至7 d，取腫瘤小鼠與正常小鼠的新鮮肝組織用多聚甲醛固定24 h（4℃）.

1.2.2 Western-blot檢測ProTα的表達(dá)水平

按文獻(xiàn)［9］提取胞質(zhì)蛋白的方法提取正常肝組織與肝癌組織細(xì)胞中的胞質(zhì).提取蛋白后移至離心管，1× 104r/min低溫離心15 min，取上清液用蛋白試劑盒進(jìn)行濃度測定并平衡，加4×Loading Buffer煮樣10 min進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），再電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，洗膜3次（每次5 min）后用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂奶粉封閉1 h，加大鼠抗ProTα抗體（1∶1 000稀釋）4℃過夜，洗膜3次（每次5 min）后，加HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（1∶2 000稀釋）常溫孵育1 h，洗膜3次（每次5 min，若背景過高，可每次洗5～10 min）后加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑進(jìn)行顯色，β微管蛋白（β-Tubulin）作參照，檢測ProTα的表達(dá)量.

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測ProTα的表達(dá)分布

將存于多聚甲醛中的正常組織與肝癌組織固定24 h后取出，梯度脫水透明后進(jìn)行包埋、切片、貼片、烤片；將制成的石蠟切片在60℃烘箱烘烤1 h，梯度透明及復(fù)水；利用抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)并洗片，加UltraSensitiveTMSP試劑盒中A試劑（內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑）10 min后洗片，再加B試劑（正常動物非免疫血清）10 min后洗片，最后加入大鼠抗Pro Tα多克隆抗體（1∶1 000稀釋）4℃過夜，陰性對照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗；次日，洗片后依次加C試劑（生物素標(biāo)記的第二抗體）、D試劑（鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶）各10 min并洗片后就可以進(jìn)行染色；用新制備好的DAB試劑進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，梯度脫水及透明后，用中性樹脂進(jìn)行封片.

1.2.4 HE染色法檢測肝組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

取肝組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水后，用蘇木精染色4 min，鹽酸酒精分色30 s，伊紅染色2 min，再一次進(jìn)行酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干并置于顯微鏡上進(jìn)行觀察拍照.

2 結(jié) 果

2.1 Western-blot法檢測結(jié)果

Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Pro Tα在正常肝細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量高（圖1（a）），而在肝癌細(xì)胞質(zhì)中幾乎無表達(dá)（圖1（b））.

圖1 Pro Tα在正常肝細(xì)胞質(zhì)（a）和肝癌細(xì)胞質(zhì)（b）中的表達(dá)水平（Western-blot）Fig.1 The expression level of ProTαin normal liver（a）and hepatocellular carcinoma tissues（b）by Western-blot

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖2所示，在正常肝組織中，Pro Tα蛋白的表達(dá)主要位于肝細(xì)胞的胞質(zhì)（圖2（a）中白色箭頭），強(qiáng)陽性表達(dá)為清晰的棕黃色顆粒，而胞核則為陰性，為蘇木精著色（圖2（a）中黑色箭頭）.正常肝組織的HE染色顯示胞質(zhì)和胞核的位置（圖2（b）），胞核大小適中，肝索清晰，同時(shí)證明在免疫組織化學(xué)中顯示陽性部位在胞質(zhì)而不是胞核；但在肝癌組織中，從HE染色可以看出，癌細(xì)胞的細(xì)胞核所占細(xì)胞比例大，胞質(zhì)比例明顯減少，肝索紊亂（圖2（e）黑色箭頭為胞核，白色箭頭為胞質(zhì)）.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肝癌組織中的細(xì)胞核顯示強(qiáng)棕色反應(yīng)，胞質(zhì)也有部分棕色反應(yīng)，但與胞核相比明顯弱（圖2（c），黑色箭頭為強(qiáng)陽性胞核，白色箭頭為弱陽性胞質(zhì)）；而陰性對照組（圖2（d））細(xì)胞核并未著色，為蘇木精復(fù)染的藍(lán)色，胞質(zhì)比例小，并且免疫組織化學(xué)也未見明顯棕色反應(yīng).免疫組織化學(xué)結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致.

3 討 論

研究顯示，與正常組織對照，一些癌組織中有高水平的Pro Tα表達(dá).Pro Tα作為肝癌［10］、肺癌［11］和神經(jīng)母細(xì)胞瘤［］的標(biāo)志物用以判斷預(yù)后.免疫組織化學(xué)研究顯示，Pro Tα在高分化甲狀腺乳頭狀和濾泡狀癌的表達(dá)量明顯高于濾泡性腺瘤、甲狀腺腫和正常組織［13］.Pro Tα作為一種核蛋白［］在細(xì)胞中的定位及其表達(dá)量具有重要的理論和實(shí)踐意義，研究表明此蛋白具有一定的可擴(kuò)散性，是一種穿梭蛋白［15］.本實(shí)驗(yàn)采用移植性肝癌作為正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟┘?xì)胞模型，應(yīng)用Western-blot法及免疫組織化學(xué)法對Pro Tα在小鼠正常肝組織與肝癌組織中的表達(dá)、分布情況進(jìn)行了測定.Western-blot結(jié)果顯示，當(dāng)肝組織正常時(shí)，Pro Tα分布在胞質(zhì)中（圖2（a）），而當(dāng)肝組織轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟┘?xì)胞時(shí)，胞質(zhì)中的Pro Tα迅速減少（圖2（c））；進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)定位結(jié)果顯示，免疫組織化學(xué)強(qiáng)陽性結(jié)果在正常肝組織中主要存在于胞質(zhì)中而胞核中較少（圖2（b）），相反，當(dāng)細(xì)胞癌變后，強(qiáng)陽性結(jié)果卻主要集中到細(xì)胞核中（圖2（e））.兩種方法檢測結(jié)果高度一致，與文獻(xiàn)［15］結(jié)果相符.以上實(shí)驗(yàn)證明，在正常肝細(xì)胞中Pro Tα主要分布在胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變之后，肝癌細(xì)胞核中Pro Tα的水平明顯升高.此外由正常肝細(xì)胞質(zhì)中Pro Tα高表達(dá)可以推測，該蛋白對穩(wěn)定細(xì)胞防止癌變有重要作用，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究.本結(jié)果目前只在動物腫瘤中發(fā)現(xiàn)，如果應(yīng)用于人的相應(yīng)腫瘤進(jìn)行驗(yàn)證，證明結(jié)果一致，將有利于臨床腫瘤的診斷和預(yù)后，并為其提供科學(xué)依據(jù).

圖2 免疫組織化學(xué)法觀察Pro Tα在肝組織中的表達(dá)水平（×40）Fig.2 The expression level of Pro Tαin liver homogenate by immunohistochemical method（×40）

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Study on the Localization of Prothymosinαin Normal and Tumor Tissues

CUI Ruo-chen，CAI Bao-wei，SU Jin-hong，HU Xin-yan，SUN Yu-han，GUO Quan，ZHOU Ke-fu*
（College of the Environment＆Ecology，Xiamen University，Xiamen 361102，China）

To study and analyze the expression and distribution of prothymosinα（Pro Tα）in normal and tumor cells of mice，twenty male Kunming mice were randomly divided into normal group and model group.Mice in the model group were inoculated with H22（Hepatoma 22）tumor cell.After 7 days，part of livers of the normal and hepatocellular carcinoma tissues were extracted to make slices for immunohistochemistry test and HE staining of ProTα，while part of tissues were homogenized，and cell lysates were extracted for Western-blot to test the expression level of Pro Tαin normal liver and hepatocellular carcinoma tissues.The results showed that the expression level of Pro Tαin the cytoplasm of normal liver cell was significantly higher than that of hepatocellular carcinoma tissue.Immunohistochemistry showed the strong positive reaction in the cytoplasm of normal tissue，and negative in the nuclei.On the contrary，hepatocellular carcinoma tissue showed strong positive immunoreactivity in the nuclei，but weak positive response in cytoplasm.The results indicated that the distribution of Pro Tαin the normal and tumor tissues was changeable and nuclei translocation of Pro Tαgradually took place during the occurrence and development of hepatocellular carcinoma.These results laid the foundation for the mechanism study of ProTαin tumor occurrence，and would be beneficial to develop diagnosis method of cancer.

prothymosinα；H22cells；hepatocellular carcinoma；localization

R 73

A

0438-0479（2015）04-0474-04

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.04.006

2014-09-22 錄用日期：2015-02-11

福建省自然科學(xué)基金（2013J01383）

*通信作者：zhkefu＠xmu.edu.cn

崔若辰，蔡報(bào)偉，蘇勁紅，等.胸腺素α原在正常組織與腫瘤組織中的定位研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，54（4）：474-477.

：Cui Ruochen，Cai Baowei，Su Jinhong，et al.Study on the localization of prothymosinαin normal and tumor tissues［J］. Journal of Xiamen University：Natural Science，2015，54（4）：474-477.（in Chinese）