去卵巢法骨質疏松樹鼩模型的建立

王運林，匡德宣，馬朝霞，王婭娟，張利東，高斌，徐顯鑫，胡敏*，段宜強*

（1.貴州醫(yī)科大學，貴陽 550025；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心，昆明 650118；3.昆明學院，昆明 650214；4.昆明醫(yī)科大學，昆明 650500)

研究報告

去卵巢法骨質疏松樹鼩模型的建立

王運林1，匡德宣2，馬朝霞3，王婭娟3，張利東3，高斌3，徐顯鑫4，胡敏3*，段宜強1*

（1.貴州醫(yī)科大學，貴陽 550025；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心，昆明 650118；3.昆明學院，昆明 650214；4.昆明醫(yī)科大學，昆明 650500)

目的采用手術雙側卵巢去勢法復制人絕經(jīng)后骨質疏松樹鼩模型。方法100只雌性樹鼩納入實驗，參照中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會2011年發(fā)布的《原發(fā)性骨質疏松癥臨床診療指南》（以下簡稱《指南》)診斷標準進行模型評價:①根據(jù)人自然壽命、性成熟時間、骨密度（BMD)峰值年齡及樹鼩自然壽命、性成熟時間，推測樹鼩BMD峰值月齡。隨機抽取6、12、18、24月齡樹鼩各6只行全身BMD檢測，比較各月齡段BMD差異，驗證樹鼩BMD峰值月齡；②從余下的樹鼩中隨機抽取BMD峰值月齡段樹鼩62只行BMD檢測，確定樹鼩BMD峰值均數(shù)與標準差。然后將其隨機分為模型組（n=32)與空白組（n=30)，模型組手術切除雙側卵巢，空白組切除與卵巢等體積的大網(wǎng)膜，各組分別于術后3、6、9、12月時隨機抽取6只行BMD檢測，對BMD值符合《指南》診斷標準者取材行病理檢測驗證。結果①6、12、18、24月齡段受測樹鼩BMD峰值分別為（0.138±0.012)、（0.143 ±0.010)、（0.141±0.009)、（0.139±0.009)g/cm2，各月齡樹鼩BMD峰值差異無顯著性（P＞0.05)；②樹鼩BMD峰值均數(shù)為（0.143±0.016)g/cm2；③模型組各時相點BMD值符合《指南》診斷標準的樹鼩的數(shù)量分別為0、5、4、5只，其脛骨近端病理切片與6月齡樹鼩比較:骨小梁稀疏、斷裂，小梁間距增寬；空白組各時相點BMD值符合《指南》診斷標準的樹鼩數(shù)量均為0，其脛骨近端病理切片與6月齡樹鼩比較無異常。結論按《指南》診斷標準判斷，6月齡雌性樹鼩行雙側卵巢去勢術后6月可復制出人絕經(jīng)后骨質疏松模型，造模成功率較高，模型穩(wěn)定。

樹鼩；卵巢切除術；骨質疏松；骨密度；石蠟病理檢查

目前，用于骨質疏松（osteoporosis，OP)造模的動物有:大鼠、兔、犬、羊和非人靈長類動物等[1-3］，OP模型中廣泛使用的動物是大鼠，但大鼠缺乏哈弗氏系統(tǒng)[4］；兔具有哈弗氏系統(tǒng)，但松質骨含量少，對檢測帶來一定困難[5］；犬的雌激素分泌水平明顯低于人類，卵巢和子宮切除不會誘發(fā)明顯的骨丟失[6］。非人靈長類動物可較好地復制人類OP模型，但飼養(yǎng)困難、體型大、成本高、實驗周期長，因而使用受到限制[7］。故采用上述動物復制的人類OP模型均存在一定不足。云南省重點開發(fā)的實驗動物樹鼩是攀鼩目樹鼩科動物，其大拇指（趾)與其他指（趾)分開、脛骨與腓骨獨立、牙齒具有前臼齒等特征；月經(jīng)周期為（26.5±8.3)d[8］，與人相似；全基因組測序發(fā)現(xiàn)其比小鼠、大鼠、犬等與人有更高的同源性[9］，與目前常用的非人靈長類動物相比，具有體型小，易于飼養(yǎng)，繁殖率高，成本低等優(yōu)點，適合于人絕經(jīng)后OP模型的研究。本研究采用手術雙側卵巢去勢法復制絕經(jīng)后OP樹鼩模型，擬為OP的研究提供新型動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

鹽酸塞拉嗪注射液（1.5×10-3L:0.03 g，聖鑫)；鹽酸苯噁唑注射液（2×10-3L:0.03 g，聖鑫)；雙能X線骨密度測量儀（Prodigy Advance型，美國GE-Lunar公司)；顯微鏡（Nikon Eclipse Ci-E，日本)；電腦超薄切片機（KD-3358，Kedee)。

1.1.2 實驗動物

100只滇西亞種雌性樹鼩，體重（128.603± 5.997)g，6～24月齡，實驗所用樹鼩均由中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學研究所提供【SCXK（滇)K2013-0001】；實驗在昆明學院分子醫(yī)學研究中心【編號: SYXK（滇)K2014-0002】進行。運輸應激反應及麻醉意外共死亡14只。

1.2 方法

1.2.1 確定滇西亞種雌性樹鼩 BMD峰值均數(shù)與標準差

（1)確定滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值取樣個體月齡:根據(jù)中國女性性成熟年齡18歲[10］，女性人均期望壽命76.7歲[11］，女性 BMD峰值年齡30歲左右[12］；雌性樹鼩性成熟年齡 6月，與雌性樹鼩自然壽命8～12歲[13］；推算樹鼩BMD峰值月齡。

（2)抽樣驗證滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值:隨機抽取6、12、18、24月齡雌性樹鼩各6只行 BMD檢測，LSD-t檢驗比較不同月齡樹鼩間的BMD峰值差異，驗證滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值適宜的取樣月齡。

（3)確定本研究中滇西亞種雌性樹鼩 BMD峰值均數(shù)與標準差:隨機抽取BMD峰值月齡雌性樹鼩62只行BMD檢測，計算其均數(shù)與標準差，以此作為滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值均數(shù)與標準差。

1.2.2 造模動物與分組

隨機選取適齡BMD峰值月齡雌性樹鼩62只，隨機分為模型組（n=32)與空白組（n=30)。臀肌注射鹽酸塞拉嗪注射液（注射劑量:0.2×10-3L/ 100 g)麻醉后，無菌條件下取腹正中切口，進入腹腔。模型組動物均切除雙側卵巢，空白組動物均切除與卵巢等體積的大網(wǎng)膜。術后立即注射鹽酸苯噁唑注射液（注射劑量:0.4×10-3L/100 g)，保溫，常規(guī)飼養(yǎng)，嚴密觀察進食、活動、掉毛、患病以及死亡情況，并記錄。兩組動物均于術前、術后3、6、9、12個月各隨機抽取6只行BMD檢測；BMD值符合《指南》[14］診斷標準者即時取材病理檢測。

1.2.3 檢測方法

（1)骨密度（BMD)檢測:測量參數(shù):電壓76.0 kV；電流0.150 mA；時間63 s；輻射劑量0.20 mrem。

（2)骨組織形態(tài)學觀察:實驗動物臀肌注射大量鹽酸塞拉嗪注射液安樂死后，取右側脛骨近端0.2 cm置于4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后再置于25% 甲酸中浸泡脫鈣，3 d后取出脫水。石蠟切片、蘇木精-伊紅（HE)染色，顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，計算結果以（±s)形式表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樹鼩的一般狀況

造模前及空白組樹鼩毛發(fā)光潔，活動體態(tài)正常；模型組逐漸出現(xiàn)反應遲鈍，活動遲緩，毛色無光澤、稀疏、脫落。

2.2 確定本研究滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值

推算出滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值月齡為10.8月；6、12、18、24月齡段受測樹鼩BMD峰值分別為（0.138±0.012、0.143±0.010、0.141±0.009、0.139±0.009)g/cm2，6、12、18、24月齡段雌性樹鼩BMD峰值差異無顯著性（P＞0.05)；62只6月齡雌性樹鼩BMD值為（0.143±0.016)g/cm2，見表1；據(jù)此確定本研究中滇西亞種雌性樹鼩BMD峰值為（0.143±0.016)g/cm2。

表1 62只6月齡雌性樹鼩BMD（g/cm2)值Tab.1 The value of BMD from 62 6-month-old female tree shrews（g/cm2)

2.3 造模結果

2.3.1 造模動物的BMD檢測結果

兩組樹鼩BMD值隨時間變化情況見圖1，模型組BMD逐漸降低，6個月時最明顯，且一直持續(xù)到12月；空白組在正常范圍內波動。按《指南》標準判斷（骨密度降低程度等于和大于同性別、同種族正常成人的骨峰值2.5個標準差為骨質疏松)，雙側卵巢去勢術后3、6、9、12個月時成模樹鼩數(shù)量分別為0、5、4、5只，造模成功率分別為0%、83%、66%、83%；空白組各時相點BMD值符合《指南》診斷標準的樹鼩數(shù)量均為0，見表3。

圖1 各時相點樹鼩全身BMD變化Fig.1 Changes of total body BMD of the tree shrews at different time points

表2 各時相點造模結果（n=6)Tab.1 The results ofmodeling at different time points

2.3.2 光鏡觀察結果

普通光鏡100倍下觀察，6月齡雌性樹鼩骨小梁排列均緊密，小梁寬厚、間距小，小梁之間連接豐富，骨髓細胞多，脂肪空泡少。造模后6個月時，空白組與造模前比較無明顯差異；模型組骨小梁數(shù)量顯著減少，排列稀疏，小梁斷裂，骨髓細胞減少，脂肪空泡多，與造模前及空白組相比較差異有顯著性，見圖2。

圖2 樹鼩脛骨近端病理切片HE染色觀察（×100)Fig.2 Histological changes of the proximal tibia of tree shrews（HE staining，×100)

3 討論

骨質疏松患病率隨著人口老齡化而逐年增加[15］。目前我國OP患者近7000萬人，其中絕經(jīng)后OP患者約占80%，且發(fā)病機理尚不完全清楚，現(xiàn)有防治策略效果有限[16］。動物模型是進行絕經(jīng)后OP基礎與臨床研究的基礎[17］。雙側卵巢去勢法是最常用的研究絕經(jīng)后OP的造模方法，其優(yōu)點是可較好地模擬絕經(jīng)后OP的病理生理狀態(tài)，造模成功率高、穩(wěn)定性可靠、重復性好、適用范圍廣[18］。本研究證實了采用手術雙側卵巢去勢法復制人類OP樹鼩模型，具有較高的成模率；動物成模后動態(tài)監(jiān)測BMD提示此OP模型具有較好的穩(wěn)定性。

評價OP動物模型的指標主要有BMD、超微螺旋CT、骨組織形態(tài)學、生化指標和生物力學等，其中雙能X線吸收法是診斷OP的“金標準”[19］，骨組織形態(tài)學檢測可直觀地觀測與評價OP的程度。故本研究采用BMD與骨組織形態(tài)學相結合的方法評價OP樹鼩模型，兩種檢測方法互為補充，結果吻合度高，方便快捷，可較好滿足本研究實驗設計需求。

目前文獻常以造模后相同時相點模型組與空白組BMD值的差異是否具有統(tǒng)計學意義為評價OP動物模型的標準，其優(yōu)點是實驗體系相對封閉，直接進行模型組與空白組之間的比較，方便快捷；缺點是結果判斷以參照組的BMD值為標準而非以種群的BMD峰值為標準，設計理念與《指南》規(guī)定的人類臨床診斷標準不盡相符。本研究中，組織學檢測結果證明參照《指南》標準評價樹鼩OP模型可較好地反映OP的疾病特征。

以《指南》診斷標準為依據(jù)，以 BMD與組織學檢測為主要評價手段，6月齡雌性樹鼩行雙側卵巢去勢術后6個月能成功建立OP模型，且具有造模成功率高、模型穩(wěn)定的優(yōu)點。由于樹鼩是近年開始發(fā)展的實驗動物，尚缺乏必要的基礎數(shù)據(jù)，遺傳背景不完全清楚，尚未標準化規(guī)模化飼養(yǎng)，可納入實驗的樹鼩數(shù)量過少，因而本研究結果尚缺乏廣泛的代表性。

[1］ 張月峰，韓景獻.骨質疏松動物模型研究進展 [J］.動物醫(yī)學進展，2005，26（3):8-11.

[2］ 徐洪璋，余斌.骨質疏松癥動物模型研究現(xiàn)狀[J］.第一軍醫(yī)大學學報，2002，22（1):47-50.

[3］ 丁桂芝，周勇.骨質疏松癥研究中動物模型的選擇與應用[J］.中國骨質疏松雜志，1997，3（3):84-88.

[4］ Ke HZ.Animal models for osteoporosis research[J］.Bone，2010，47（Suppl3):349-350.

[5］ 廖慧娟，廖二元.骨質疏松癥動物模型[J］.國外醫(yī)學內分泌學分冊，2004，24（1):60-62.

[6］ 李素萍.骨質疏松動物模型的研究現(xiàn)狀 [J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（20):3767-3770.

[7］ Jerome CP，Peterson PE.Nonhuman primate models in skeletal research[J］.Bone，2001，29（1):1-6.

[8］ 吳強，劉棒深，劉玲玲，等.樹鼩血漿生殖激素初步研究[J］.上海實驗動物科學，1989，9（3):140-141.

[9］ Yu F，Huang ZY，Cao CC.et al.Genome of the Chinese tree shrew[J］.Nature Comm，2013，4（2):66-78.

[10］ 謝幸，茍文麗.婦產(chǎn)科學[M］.第八版.中國:人民衛(wèi)生出版社，2013:14.

[11］ Khalid M.Human Development Report 2014[M］.USA，The United Nations Development Programme，2014:177.

[12］ 全國十三省市骨礦含量調查合作組.骨骼生長衰老規(guī)律和原發(fā)性骨質疏松癥預診的研究[J］.中國骨質疏松雜志，1995，1（1):1-7.

[13］ Hubrecht R，Kirkwood J.The UFAW handbook on the care and management of laboratory and other research animals:Tree shrew [M］.Eighth Edition.Singapore:Robert Hubrecht and James Kiskwood，2009:262-275.

[14］ 中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會.原發(fā)性骨質疏松癥診治指南（2011年)[J］.中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2011，4（1):2-17.

[15］ Rejinster JY，Burlet N.Osteoporosis:A still increasing prevalence[J］.Bone，2006，38（2):4-9.

[16］ 吳海洋，索歡，王平.絕經(jīng)后骨質疏松癥的臨床中藥治療進展[J］.中國骨質疏松雜志，2015，21（2):241-244.

[17］ Turner AS.Animalmodels of osteoporosis—necessity and limitation[J］.Eur Cells Mat，2001，1:66-81.

[18］ 程群，朱漢民.建立骨質疏松動物模型的標準化問題 [J］.老年醫(yī)學與保健，2003，9（2):122-124.

[19］ Link TM.Osteoporosis imaging:state of the art and advanced Imaging[J］.Radiology，2012，263:3-17.

Establishment of an osteoporosismodel in tree shrews bj bilateral ovariectom j

WANG Yun-lin1，KUANG De-xuan2，MA Zhao-xia3，WANG Ya-juan3，ZHANG Li-dong3，GAO Bin3，XU Xian-xin4，HU Min3*，DUAN Yi-qiang1*
（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.Center of Tree Shrew Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Kunming 650118；3.Kunming University，Kunming 650214；4.Kunming Medical University，Kunming 650500)

ObjectiveTo establish an osteoporosis model in tree shrews by bilateral ovariectomy.Methods One hundred healthy 6-24month old female tree shrewswere used in this study.The diagnosis and treatmentofosteoporosis in themodel tree shrewswas assessed according to the Interpretation of the Clinical Practice Guideines for Primary Osteoporosis 2011 released by the Chinese Medical Association of Osteoporosis and Bone Mineral Salt Disease Branch.① According to the human natural life span，sexualmaturation time and peak bonemineral density（PBMD)and the tree shrew natural life span and sexualmaturation time，we estimated the PBMD of tree shrew in the age ofmonths.Six 6-，12-，18-and 24-month old tree shrews in each group were randomly taken formeasurement of BMD，and compared the differences between groups to verify the PBMD age of tree shrews.②We chose 62 6-month old tree shrews from the restof tree shrews tomeasure their BMD to determine themean and standard deviation of BMD.Then we divided them into study group（n= 32)and control group（n=30).Bilateral ovariectomy was performed in the study group，while omentectomy was done in the control group.BMD wasmeasured at3，6，9，12 months after the surgery，6 animals from each group.The animals which met the criteria of guideline were taken for pathological examination.Results①The PBMD of6-，12-，18-，24-month old tree shrews was 0.138±0.012，0.143±0.010，0.141±0.009，and 0.139±0.009)g/cm2，respectively，showing no significant differences among them（P＞0.05).②Themean PBMD of the tree shrews was 0.143±0.016 g/ cm2.③In themodel groups，the number of tree shrewswhose BMDmet the criteria of guideline was0，5，4，5，respectively.The pathological examination of the proximal tibia from themodel group showed sparse and some disrupted trabeculae and enlarged inter-trabecular space.In the control group，the tibia tissues showed normal histology of bone structure and no one tree shrew showed a BMD value whichmet the criteria of diagnosis of osteoporosis.Conclusions An osteoporosismodel in tree shrews can be established at6 months after bilateral ovariectomy，showing similarmanifestation of osteoporosis in postmenopausalwomen.The success rate of thismodelingmethod is high and themodel is stable.

Tree shrew；Ovariectomy；Osteoporosis；Bonemineral density；Pathology

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0562-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.003

2015-09-24

國家科技支撐計劃項目子課題（2014BAI01B01)。

王運林（1988-)，男，碩士生，研究方向:骨關節(jié)，E-mail:185281780@qq.com。

段宜強，副主任醫(yī)師，研究方向:骨關節(jié)，手顯微，E-mail:784853938@qq.com。胡敏，教授，主要研究方向:骨科基礎與臨床，E-mail:576794680@qq.com。