五味甘露藥浴散加減方對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF和滑膜組織JNK1的影響

韋 婷，劉 宇，王天虹，吳嘉思，張 藝，曾 勇

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

五味甘露藥浴散加減方對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF和滑膜組織JNK1的影響

韋 婷，劉 宇，王天虹，吳嘉思，張 藝，曾 勇

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

觀察五味甘露藥浴散加減方對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的療效及對大鼠血清RF和踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1的的影響.采用弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis Rats，AA)大鼠模型，用大鼠致炎側(cè)足跖腫脹率評價五味甘露藥浴散加減方對AA大鼠的治療效果，ELISA法測定血清中RF的水平，免疫組化法測定踝關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白激酶JNK1的表達.實驗結(jié)果表明，與模型組比較，給藥四周，五味甘露藥浴散加減方高劑量能有效減少致炎側(cè)足跖腫脹率(P＜0.05);給藥兩周和四周，五味甘露藥浴散加減方高劑量能明顯降低血清中RF的水平(P＜0.05).五味甘露藥浴散加減方各劑量均能顯著降低踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1的表達(P＜0.05或P＜0.01).五味甘露藥浴散加減方能有效的減小佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠致炎側(cè)足跖腫脹率，其作用機制可能與其降低血清中RF的水平和滑膜組織JNK1的表達有關(guān).

五味甘露藥浴散加減方;佐劑型關(guān)節(jié)炎;腫脹率;RF;JNK1

藏藥浴療法是藏醫(yī)治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的 常用手段［1］.“五味甘露”方是藏藥浴的基礎(chǔ)配方，最早記載于藏醫(yī)經(jīng)典巨著《四部醫(yī)典》［2-3］.臨床多采用五味甘露藥浴散基本方加減進行治療.藏醫(yī)理論認(rèn)為的關(guān)節(jié)腫痛、四肢僵直、肌肉萎縮等“黃水”性疾病，屬于藏醫(yī)學(xué)中“真布”范疇，藏藥浴治療“真布”歷史悠久［4］.該病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類似.但目前缺少五味甘 露藥浴散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)藥效機制報道，因此，本研究擬在藏醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠模型，測定給藥兩周及給藥四周AA大鼠致炎側(cè)足跖腫脹率和血清RF的水平，踝關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白激酶JNK1的表達，初步探討五味甘露藥浴散加減方防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制.

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠(SPF級)，體重200±20 g，成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2013-24.

1.2 實驗藥品、試劑

五味甘露藥浴散加減方，由西藏藏醫(yī)學(xué)院制備，方藥組成:刺柏葉500 g，水柏葉500 g，麻黃500 g，大籽蒿500 g，青稞100 g，峨?yún)?0 g，喜馬拉雅紫茉莉10 g，蒺藜 10 g，黃精 10 g，乳香10 g，天門冬 10g，決明子10 g，黃葵子 10 g，堿花 10 g，甘松 10 g，巖精 10 g，寒水石10 g，黃硫磺10 g.

醋酸地塞米松:規(guī)格0.75mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字 H33020822，產(chǎn)品批號:130123

完全弗氏佐劑(Freund＇s Adjuvant Complete)，Sigma 公司，批號:(#SLBF 9338V)，規(guī)格:1 mg.mL-1滅活結(jié)核桿菌;卡介苗凍干粉，上海瑞楚生物科技有限公司，批號:201409，規(guī)格:60mg/支.完全弗氏佐劑中再次加入一定劑量滅活的卡介菌，制備成10 mg.mL-1滅活結(jié)核桿菌的完全弗氏佐劑，4℃冷藏保存?zhèn)溆?

RF ELISA試劑盒:批號 YAD 2015043002，購置于北京雅安達生物技術(shù)有限公司.一抗:JNK1抗體，兔多克隆抗體，批號:ab199380，德國默克集團--密理博中國有限公司;二抗:生物素化山羊抗兔IgG(H+L)，批號:13152A11;三抗:辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批號:13152A11.二抗，三抗均購置于北京中衫金橋生物有限公司;

1.3 儀器

足趾容積測量儀，泰盟PV-200，成都泰盟科技有限公司;轉(zhuǎn)輪式切片機，2015型，德國徠卡(Leica)儀器有限公司;全自動封閉式組織脫水機，TSJ-Ⅱ型，常州市中威電子儀器有限公司;病理組織漂烘儀，PHY-Ⅲ型，常州市中威醫(yī)療儀器有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，美國 Media Cybernetics公司;VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司.

2 方法

2.1 造模分組給藥

SD健康大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機選取10只作為正常對照組，其余50只于大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1mL(次.只)-1弗氏完全佐劑致炎，正常對照組在右側(cè)后肢足跖皮下注射0.1 mL生理鹽水，用足趾容積測量儀測量致炎前大鼠右后足足容積(mL)2次，取其平均值作為致炎前正常足容積作為基礎(chǔ)值.16 d后大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀出現(xiàn)，成功誘發(fā)AA大鼠模型.將AA大鼠隨機分為模型組，地塞米松組，五味甘露藥浴散加減方高劑量組(104.00 g.L-1)、中劑量組(52.00 g.L-1)、低劑量組(26.00 g.L-1).

五味甘露藥浴散加減方高、中、低劑量組每天藥浴1次，每次30 min，溫度控制在40℃.模型組和正常組每天同體積溫水浴，條件同藥浴組，地塞米松組每天(0.150 mg.kg-1)灌胃1次，連續(xù)給藥4周.

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1 足跖腫脹率

給藥2周及4周，測定致炎側(cè)足容積，計算出足跖腫脹率［5］.足跖腫脹率=(致炎后足容積平均值-致炎前足容積的平均值)/致炎前足容積的平均值×100%.

2.2.2 血清RF測定

給藥第2周，大鼠后眼眶靜脈取血1.5mL，分離血清，采用ELISA法，按照試劑盒說明書，測定大鼠血清中細胞因子RF水平.

給藥4周，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3mLkg-1麻醉，然后從腹主動脈取血2 mL，分離血清，采用ELISA法，按照試劑盒說明書，測定血清中細胞因子RF水平.

2.2.3 免疫組化法測定大鼠踝關(guān)節(jié)炎滑膜組織JNK1的表達

給藥4周，大鼠麻醉取血處死，剪下致炎側(cè)足踝關(guān)節(jié)，用10%甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片，采用S-P(streptavidin-perosidase)免疫組化法，一抗稀釋比為1∶200，顯色后中性樹膠封片.

2.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，所有指標(biāo)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析比較組間差異.

3 實驗結(jié)果

3.1 致炎側(cè)足跖腫脹率結(jié)果

與模型組比較，地塞米松組給藥2周和4周致炎側(cè)足跖腫脹率顯著減小(P＜0.01)，五味甘露藥浴散加減方高劑量組給藥4周足跖腫脹率明顯減小(P＜0.05).如表1.

表1 給藥2、4周各組大鼠致炎側(cè)足跖腫脹率比較(±s，n=10，%)Table 1 Comparisons of Joint swelling rate with acute inflammation for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，%)

表1 給藥2、4周各組大鼠致炎側(cè)足跖腫脹率比較(±s，n=10，%)Table 1 Comparisons of Joint swelling rate with acute inflammation for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，%)

注:與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量 給藥2周 給藥4周＊＊模型對照 - 54.621±11.650 48.172±9.381地塞米松 0.150mg.kg-1 29.302±14.830＊＊ 37.674±9.637＊＊五味甘露藥浴散加減方 26.00g.L-1 52.917±14.428 43.575±7.479 52.00g.L-1 52.297±14.428 43.206±17.839 104.00g.L-1 50.064±8.877 40.910±8.963*正常對照 - 0.023±6.945＊＊ 5.576±4.054

3.2 血清RF測定

給藥2、4周，與正常組比較，模型組大鼠血清RF含量顯著升高(P＜0.05)，與模型組比較，地塞米松組、五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠血清RF含量明顯降低(P＜0.05).如表2.

表2 給藥2、4周各組大鼠血清RF水平比較(±s，n=10，nmol/L)Table 2 Comparisons of serum RF of rat for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，nmol/L)

表2 給藥2、4周各組大鼠血清RF水平比較(±s，n=10，nmol/L)Table 2 Comparisons of serum RF of rat for treatment of 2 and 4 weeks.(-x ± s，n=10，nmol/L)

注:與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量 給藥2周 給藥4周正常對照 - 126.168±33.266* 149.320±45.407*模型對照 - 157.814±19.870 190.334±28.533地塞米松 0.150mg.kg-1 129.748±28.059* 150.368±37.946*五味甘露藥浴散加減方 26.00g.L-1 150.683±44.811 183.658±35.262 52.00g.L-1 166.548±53.856 172.811±34.238 104.00g.L-1 122.719±43.250* 159.033±24.424*

3.2 踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1表達水平

與正常對照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，與模型對照組相比，地塞米松組、五味甘露藥浴散加減方高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，中劑量組、低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1蛋白表達降低(P＜0.05).如表3圖1.

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)炎滑膜組織JNK1表達水平比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of JNK1 expression of the synovial membrane of adjuvant arthritis rats

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)炎滑膜組織JNK1表達水平比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of JNK1 expression of the synovial membrane of adjuvant arthritis rats

注:與模型組比較 *P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量＊＊模型對照 - 0.2193±0.0165地塞米松 0.150mg.kg-1 0.1796±0.0181＊＊五味甘露藥浴散加減方 26.00g.L-1 0.1978±0.0240*52.00g.L-1 0.1984±0.0264*104.00g.L-1 0.1916±0.0223 JNK1正常對照 - 0.1672±0.0155＊＊

圖1 大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化(IHC×400)A.正常對照組;B.模型組;C.地塞米松組0.150mg.kg-1;D.五味甘露藥浴藥浴散加減方低劑量組26.00g.L-1;E.五味甘露藥浴藥浴散加減方中劑量組52.00g.L-1;F.五味甘露藥浴藥浴散加減方高劑量組104.00g.L-1Fig.1 Immunohistochemistry of Ankles in Adjuvant Arthritis Rats(IHC ×400)A.nomal group;B.model group;C dexamethasone group(0.150mg.kg-1);D Ganlu-Yaoyu-San in high dose group(104.00g.L-1);E Ganlu-Yaoyu-San in middle dose group(52.00g.L-1);F Ganlu-Yaoyu-San in low-dose group(26.00g.L-1)

4 討論

目前治療RA的藥物主要集中在非甾體抗炎藥、腎上腺糖皮質(zhì)激素，免疫抑制劑等，上述藥物以緩解癥狀為主，不良反應(yīng)較多，患者耐受性差［6］.藏藥浴是依據(jù)藏醫(yī)藥的基礎(chǔ)理論在溫泉浴療法實踐的基礎(chǔ)上創(chuàng)造的一種藏醫(yī)獨特的藥物外治類風(fēng)濕的方法，“五味甘露”方是藏藥浴的基礎(chǔ)配方.研究表明五味甘露顆粒能抑制各種炎癥模型所致炎癥，并有顯著的鎮(zhèn)痛作用［7］.對中醫(yī)寒濕痹阻、濕熱疲阻、肝腎虧虛、痰癖痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均能起到良好療效，尤其對寒濕痹阻型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效顯著.

足跖腫脹率是評價AA模型后肢炎癥輕重程度的外部客觀指標(biāo)［8］，研究表明，RA的發(fā)病與多種自身抗體及細胞因子相關(guān)，包括類風(fēng)濕因子(RF)、環(huán)瓜氨酸多膚抗體(抗一 CCP)及葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(UPI)等［9］.Vittccoq 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生明顯早于患者臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)，對RA的早期診斷具有重要價值.RF作為RA檢測的重要指標(biāo)，是損傷指標(biāo)中最強有力的預(yù)后因子［11］.有研究表明高滴度RF與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)侵蝕密切相關(guān).MAPK信號通路參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)，以往研究發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中JNK和p38途徑的活化明顯增強［12-13］，參與關(guān)節(jié)局部炎癥及骨質(zhì)破壞，具有重要的致病意義.JNK是轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，其抑制劑對控制RA有一定療效.JNK抑制劑可下調(diào)MMPs的表達，減少軟骨的破壞，對軟骨有一定的保護作用［14-15］.研究表明，JNK磷酸化和膠原酶基因表達都需要TNF-a，IL-1的有效誘導(dǎo)，它們是RA發(fā)病中重要的炎癥因子.

本實驗研究結(jié)果表明，五味甘露藥浴散加減方能有效減小致炎側(cè)足跖腫脹率，提示該藥藥浴可以明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)具有一定的治療作用.進一步研究發(fā)現(xiàn)該藥可明顯降低AA大鼠血清中RF的水平，抑制踝關(guān)節(jié)滑膜組織JNK1的表達.提示其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機制可能與其降低血清RF含量，抑制JNK1的表達有關(guān).

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Effect of Ganlu-Yaoyu-San on rats with adjuvant arthritis Serum RF level and JNK1 of synovial tissue

WEI Ting，LIU Yu，WANG Tian-hong，WU Jia-si，ZHANG Yi，ZENG Yong
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，P.R.C.)

This article studied the efficacy of Ganlu-Yaoyu-Sanon the rats with adjuvant arthritis，and its effect on the levels of serum RF and the expression of JNK1 in ankle synovial tissue.The model of arthritis in rats was induced by Freund＇s complete adjuvant(FCA).The inflammatory side paw swelling rate was used to evaluate the treatment effect of Ganlu-Yaoyu-San in AA rats.The level of serum RF was tested by ELISA and the expression of JNK1 in ankle joint synovial tissue was determined by immuno-histochemistry.The results showed that high dose of Ganlu-Yaoyu-San could significantly reduce the AA rats inflammatory side swelling rate(compared with model group，P＜0.05)with 4 weeks of treatment.With 2 and 4 weeks of treatment，in high dose group of Ganlu-Yaoyu-San the level of serum RF was significantly lower than that in model group(P＜0.05).Moreover，each dosage Ganlu-Yaoyu-San group could significantly reduce the expression of JNK1 in ankle synovial tissue(P＜0.05 orP＜0.01).Ganlu-Yaoyu-San could effectively reduce the inflammatory side foot swelling rate in adjuvant arthritis rat and the mechanism might be related to the effect on the level of RF in serum and the expression of JNK1 in ankle synovial tissue.

Ganlu-Yaoyu-San;adjuvant arthritis;swelling rate;RF;JNK1

R285

A

2095-4271(2015)06-0708-05

10.11920/xnmdzk.2015.06.009

2015-08-29

韋婷(1990－)，女，漢族，四川人，在讀碩士研究生，研究方向:中藥藥效與毒理研究，E-mail:949856850@qq.com

曾勇(1976－)，男，漢族，四川人，博士，副教授，研究方向:中藥藥效與毒理研究E-mail:286840942@qq.com

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(81260672);四川省科技廳省青年科技創(chuàng)新研究團隊專項計劃項目(2014TD0007)

(責(zé)任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏;英文編輯:周序林，鄭玉才)