MMP-11在胃癌組織的表達(dá)及臨床意義

李 博 毛穎民 楊建生 趙仲生

MMP-11在胃癌組織的表達(dá)及臨床意義

李 博 毛穎民 楊建生 趙仲生

目的 觀察MMP-11蛋白在胃癌組織的表達(dá)。方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測436份胃癌組織及92份鄰近正常胃黏膜組織石蠟標(biāo)本MMP-11表達(dá)情況。結(jié)果 MMP-11在正常胃黏膜組織的表達(dá)低于胃癌組織（0 vs 47.5%，χ2＝73.424，P＜0.01）。MMP-11表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小、分化、侵犯深度、分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、Lauren分型相關(guān)（P＜0.05），而與組織類型、性別無關(guān)。腫瘤≥5cm者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率62.8%，明顯高于腫瘤＜5cm者的36.7%（χ2＝28.781，P＜0.001）；彌漫型者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率明顯高于腸型者（85.9%比10.7%，χ2＝246.751，P＜0.001）；T3、T4期者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率分別為58.6%、96.2%，明顯高于T1、T2期的10.5%、30.3%（χ2＝80.969，P＜0.001）；Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率分別為68.8%、95.7%，高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的7.8%、14.4%（χ2＝198.170，P＜0.001）；脈管侵犯者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率明顯高于無脈管侵犯者（70.0%比16.4%，χ2＝122.193，P＜0.001）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者的MMP-11陽性表達(dá)率為68.9%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的12.7%（χ2＝130.382，P＜0.001）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的MMP-11陽性表達(dá)率95.1%，高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的39.7%（χ2＝64.455，P＜0.001）。根據(jù)多因素Logistic回歸分析，MMP11的表達(dá)在TNM分期高、脈管侵犯、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中發(fā)生率高。結(jié)論 MMP-11或參與了胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移進(jìn)程，檢測MMP-11的表達(dá)可作為判斷胃癌生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)。

胃腫瘤；浸潤轉(zhuǎn)移；基質(zhì)金屬蛋白酶-11

圖1 MMP-11在正常胃黏膜組織中的陰性表達(dá)（SP法× 400）

圖2 MMP-11在胃低分化腺癌中的強(qiáng)陽性表達(dá)（SP法× 400）

圖3 MMP-11在胃低分化腺癌中的強(qiáng)陽性表達(dá)（SP法× 100）

圖4 MMP-11在胃中分化腺癌中的強(qiáng)陽性表達(dá)（SP法× 400）

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，參與腫瘤的血管、淋巴管生成、腫瘤浸潤生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移多個(gè)過程[1-2]，是整個(gè)惡性腫瘤自然生長過程中癌細(xì)胞主動(dòng)配體，在腫瘤的發(fā)展起著重要作用[3]，與腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們采用免疫組化的方法分析MMP-11蛋白在胃癌組織的表達(dá)，為臨床腫瘤的診治尋找新的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇1998年1月—2004年12月在浙江省人民醫(yī)院接受手術(shù)治療、資料完整的胃癌患者436例436份胃癌組織為實(shí)驗(yàn)樣本，均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)任何治療。HE切片后由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生核實(shí)臨床病理診斷，選取樣點(diǎn)做成組織芯片。取同期距癌邊緣5cm以上的臨近無增生或不典型增生的非腫瘤胃黏膜標(biāo)本92份為對(duì)照。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)儀器 組織芯片制備系統(tǒng)HT－1型（遼寧朝陽恒泰科技發(fā)展有限公司），Olympus CH3D光學(xué)顯微鏡（日本Olympus Optical CD公司）。

1.2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人MMP-11抗體（美國ADCAM公司），山羊血清工作液和廣譜二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 免疫組化方法

1.3.1 切片制作 切片后過夜；二甲苯15min浸2次；100%酒精浸3次、95%酒精浸2次、80%酒精浸1次、75%酒精浸1次，1次浸5min；蒸餾水沖洗5min 1次；0.01M、pH7.4 PBS洗5min×2次。

1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法染色 枸櫞酸鹽緩沖液（0.01M、pH6.0）高壓修復(fù)3min，自然冷卻后，PBS沖洗5min×3次；3%H2O2中室溫下避光孵育15min，PBS沖洗5min×3次；山羊血清工作液室溫下孵育10min；傾去血清，直接滴加一抗工作液（MMP-11稀釋比1:50），4℃過夜。PBS沖洗3min×3次；滴加廣譜二抗試劑，室溫孵育30min。PBS沖洗3min×3次；DAB光鏡下控制顯色、自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化；切片脫水、透明、封片：將上述切片依次經(jīng)85%酒精2～5min；95%酒精2～5min；100%酒精5min×2次；二甲苯10min×2次；中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.3.3 免疫組化染色結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)定和分析：基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分；≥51%記3分。將每張切片的染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），＞6分為強(qiáng)陽性（+++）。在統(tǒng)計(jì)分析中，將表達(dá)（－/＋）劃為陰性表達(dá)，（＋＋～＋＋＋）劃為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間的MMP-11陽性表達(dá)率比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)單因素統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇相關(guān)多個(gè)因素采用多因素Logistic分析。

2 結(jié)果

2.1 正常胃黏膜組織和胃癌組織MMP-11的表達(dá)

在92份非腫瘤胃黏膜組織中，MMP-11蛋白均為陰性表達(dá)，無強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1（封二）。436份胃癌組織中，強(qiáng)陽性表達(dá)129份（29.6%），中等陽性表達(dá)78份（17.9%），MMP-11蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為47.5%，與正常胃黏膜組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0 vs 47.5%，χ2＝73.424，P＜0.01）。胃癌表達(dá)MMP-11陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和（或）間質(zhì)組織中，呈非均質(zhì)性，見圖2～4（封二）。

2.2 MMP-11蛋白表達(dá)與胃癌病理學(xué)指標(biāo)間的關(guān)系

腫瘤≥5cm者的MMP-11陽性表達(dá)率62.8%，明顯高于＜5cm者的36.7%（P＜0.001）；彌漫型胃癌MMP-11陽性表達(dá)率明顯高于腸型（P＜0.001）；T3、T4期MMP-11陽性表達(dá)率明顯高于T1、T2期（P＜0.001）；Ⅲ期、Ⅳ期胃癌MMP-11陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期MMP-11（P＜0.001）；脈管侵犯者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率高于無脈管侵犯者（P＜0.001）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.001）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-11陽性表達(dá)率明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（P＜0.001）。MMP-11蛋白表達(dá)與胃癌病理學(xué)指標(biāo)間的關(guān)系見表1。

選擇MMP-11陽性表達(dá)的指標(biāo)、腫瘤大小、Lau－ren分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期，根據(jù)多因素Logistic回歸分析，MMP11的表達(dá)在TNM分期高、脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中發(fā)生率較高，見表2。

表1 MMP-11在胃癌組織的表達(dá)及與胃癌病理指標(biāo)間的關(guān)系

表2 logistic回歸分析MMP-11與胃癌病理指標(biāo)間的相關(guān)因素

3 討論

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征之一，腫瘤細(xì)胞要發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，首先必須突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障。MMPs則是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類,能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-11屬于MMPs家族，并具有一些獨(dú)特的特性，①M(fèi)MP-11能降解非細(xì)胞外基質(zhì)的絲氨酸蛋白酶抑制劑、α1抗胰蛋白酶、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1[4-5]；②MMP-11在細(xì)胞內(nèi)以45kDa的酶形式為活化狀態(tài)釋放[1]。而大多數(shù)MMPs以無活性的酶原形式分泌到細(xì)胞外，在細(xì)胞外才被激活[1]。臨床發(fā)現(xiàn)，MMP-11在大多數(shù)惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、口腔癌和食管癌組織有表達(dá)。Delebecq[6]研究129例非小細(xì)胞肺癌，對(duì)比分析u-PA、MMP-2、MMP-11組織蛋白酶類B、L的表達(dá)和腫瘤的病理學(xué)分型、腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)系，認(rèn)為MMP-11與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)，可以作為臨床判斷的一個(gè)指標(biāo)。

Masson[7]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-11缺失小鼠中惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程明顯發(fā)生改變。MMP-11缺失抑制7，12-二甲基苯并蒽誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的能力，MMP-11缺失小鼠的成纖維細(xì)胞也失去促進(jìn)MCF7腫瘤細(xì)胞株局部種植的能力。MMP-11的作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]，與SP1位點(diǎn)，及ERK1/2-有絲分裂原活化激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）信號(hào)通路有關(guān)。Takeuchi[9]發(fā)現(xiàn)MMP-11能夠抑制癌細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)腫瘤生長。Boulay[10]研究發(fā)現(xiàn)MMP-11酶缺失鼠中，腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死情況明顯高于野生型鼠。說明MMP-11降低了腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死而影響腫瘤的進(jìn)展。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，MMP-11通過改變基質(zhì)環(huán)境而創(chuàng)造有利于腫瘤細(xì)胞生存的環(huán)境，影響腫瘤的進(jìn)展。MMP-11缺陷小鼠腫瘤細(xì)胞脂肪浸潤及凋亡有明顯提高[12]。

我們通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織MMP-11蛋白的表達(dá)水平與腫瘤大小、lauren分型、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期相關(guān)（P＜0.05）， MMP-11高表達(dá)組腫瘤浸潤較深，較易侵犯脈管，而且也較易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，與低表達(dá)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-11高表達(dá)組多為Ⅲ、Ⅳ期，MMP-11低表達(dá)組則多處于Ⅰ、Ⅱ期，隨著分期進(jìn)展，MMP-11表達(dá)升高。多因素Logistic回歸分析，MMP11表達(dá)在TNM分期高、脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中發(fā)生率高，也就是在腫瘤發(fā)生局部侵犯、局部脈管侵犯、遠(yuǎn)處種植轉(zhuǎn)移等腫瘤生長、侵襲活動(dòng)劇烈時(shí)，MMP-11的表達(dá)明顯升高，提示MMP-11的高發(fā)達(dá)可能，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲。

綜上所述，MMP-11在腫瘤的發(fā)病及惡化進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用[13]，可能是一個(gè)重要的腫瘤發(fā)展因素，對(duì)胃癌的預(yù)后判斷有一定的參考價(jià)值。

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（收稿：2014-10-16 修回：2015-01-28）

Expression of MMP-11 in Gastric Cancer Tissues and Its Clinical Significance

LI Bo1,MAO Yingmin1,YANG Jiansheng1,ZHAO Zhongsheng2.1 Interventional Medicine Ward；2Department of Pathology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate the expression of MMP-11 in gastric cancer.M ethods MMP-11 expression in sample tissues from 436 cases with gastric cancer and 92 cases of cancer adjacent gastric mucosa was detected immunohisochemically.Results MMP-11 expression in cancer adjacent gastric mucosa was significantly lower than that in gastric cancer tissues（0 vs 47.5% χ2＝73.424,P＜0.01）.MMP-11 expression was related to tumor size,differentiation,depth of invasion,stage,lymph node metastasis,distant metastasis,vascular invasion,and Lauren classification of gastric cancer（P＜0.05）,but was not associated with histologic type and gender of patients（P＞0.05）.MMP-11 positive rate in gastric cancer patients with tumor size≥5cm was significantly higher than that in patients with tumor size＜5cm（62.8%vs 36.7%;χ2＝28.781,P＜0.001）;that in patients with diffusing type cancer increased to 85.0%as compared with 10.7%in patients with intestinal-type cancer（χ2＝246.751,P＜0.001）;that in patients at stage T3 and T4 was 58.6%and 96.2%,respectively,which were higher than that in patients at stage T1 and T2（10.5%and 30.3%,χ2＝80.969,P＜0.001）;that in patients with stageⅢ,Ⅳ cancer（68.8%,95.7%）were significantly higher than that in patient with stageⅠ,Ⅱ cancer（7.8%,14.4%;χ2＝198.170,P＜0.001）;that in patients with vascular invasion was 70.0%as compared with 16.4%of patients without vascular invasion MMP-11（χ2＝122.193,P＜0.001）;that in patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis（68.9%vs 12.7%;χ2＝130.382,P＜0.001）;that in patients with distant metastasis increased to 95.1% as compared with 39.7%in patients without distant metastasis（χ2＝64.455,P＜0.001）.Multi-factor logistic regression analysis showed that MMP-11 high expression was seen in patients with high TNM staging,vascular invasion,ordistant metastasis.Conclusion MMP-11 may involve in process of invasion and metastasis of gastric cancer. MMP-11 could be used as an important reference indicator for evaluation of biological behavior of gastric cancer.

gastric neoplasma;neoplasma invasion;matrix metalloproteinases-11

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014KYA013）

浙江省人民醫(yī)院介入病房（李博、毛穎民、楊建生）、病理科（趙仲生）（杭州 310014）

李博，Tel：13989856315；E-mail：13989856315@163.com