副豬嗜血桿菌的分離鑒定及血清型分析

鐘敏，胡艷，蘇州，鐘云平，郭禮榮，邱光忠

（贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341401）

副豬嗜血桿菌?。℉PS）又稱為纖維素性漿膜炎和關節(jié)炎，也稱革拉瑟氏病。全世界均有發(fā)生。在豬無名高熱病流行中，副豬嗜血桿菌病也是并發(fā)癥之一。副豬嗜血桿菌是居于健康豬的上呼吸道的常在菌，在特定條件下可以侵入機體，主要危害2～4周齡的豬，通常見于5～8周齡，特別是斷奶前后和保育仔豬多發(fā)，發(fā)病率10%～40%不等。HPS血清型復雜多樣，按照KRG瓊脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型。蔡旭旺等[1]研究表明我國以血清4型和5型最為流行，其次為13型，14型和12型。急性病例，往往首先發(fā)生于體況良好的豬，病豬發(fā)熱（40.5℃～42℃）、精神沉郁、食欲廢絕，呼吸困難，皮膚蒼白，耳梢發(fā)紫，眼瞼水腫，行走緩慢或不愿站立，腕關節(jié)、跗關節(jié)腫大，共濟失調(diào)，臨死前四肢呈劃水樣。有時也會無明顯癥狀而突然死亡。慢性病例多見于保育豬，主要是食欲下降、咳嗽、呼吸困難，被毛粗亂，跛行，甚至衰竭死亡。感染母豬多出現(xiàn)關節(jié)腫脹、跛行、顫抖等亞臨床癥狀。剖檢可見纖維素性或漿液性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎[2]。

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化和集約化發(fā)展，動物福利水平相對落后，副豬嗜血桿菌病常作為繼發(fā)性病原菌，在藍耳病病毒、圓環(huán)病毒II型、偽狂犬病病毒及流感病毒等感染后繼發(fā)感染，并呈逐年上升趨勢，甚至與傳染性胸膜炎放線桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌等混合感染，使病情嚴重化，死亡率增加，引起眾多豬場的高度重視。本試驗從江西贛州18個縣送本試驗室檢測的疑似患多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎的156份病料中分離到127株細菌，采用細菌分離培養(yǎng)和生化試驗進行初步鑒定，再用PCR檢測的方法最終確定47株為HPS，并用瓊脂擴散試驗對分離菌株的血清型進行鑒定，了解副豬嗜血桿菌病在贛州地區(qū)流行情況，并通過藥敏篩選分離株敏感藥物，為該病的綜合防控及治療提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 病料來源

從江西贛州市18個縣34個豬場共收集156病料，病豬出現(xiàn)呼吸困難、跛行，剖檢可見漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎等。

1.2 試驗試劑與儀器

副豬嗜血桿菌標準陽性血清1～15型，由本實驗室保存、提供；微量生化鑒定試劑、TSA固體培養(yǎng)基，購自青島易邦生物工程有限公司；新生牛血清，購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均為大連寶生物公司產(chǎn)品；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司，PCR擴增儀購自美國PE公司。

2 試驗方法

2.1 細菌分離鑒定

2.1.1 病原菌的分離。無菌操作從病豬的鼻腔、肺臟、胸膜、心包積液、關節(jié)液和腦組織等病料中取樣，劃線接種于含5%新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基，挑取單個疑似HPS的菌落純培養(yǎng)后進行鑒定。

2.1.2 細菌形態(tài)鑒定。取單個菌落，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，觀察其形態(tài)及染色特性，保存，備用。

2.1.3 培養(yǎng)特性觀察。取純化菌落分別接種于普通血平板、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及含V因子LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落生長情況。

2.1.4 衛(wèi)星試驗。用接種環(huán)挑取可疑單菌落，水平劃線接種于綿羊鮮血平皿，再挑取金黃色葡萄球菌垂直水平線劃線，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察是否有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”和溶血現(xiàn)象。

2.1.3 生化特性鑒定。取具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于微型生化鑒定管，按廠家說明書方法操作并觀察結(jié)果。

2.2 PCR鑒定

參照文獻[3]方法從HPS培養(yǎng)物中提取DNA,參照Simone Oliveira等[4]報道方法進行PCR擴增試驗。

2.3 血清型鑒定試驗

根據(jù)蔡旭旺等[1]方法制備各分離菌株的血清學分型抗原，以各血清型標準血清對各分離株進行瓊脂擴散試驗，以確定各分離株的血清型。

2.4 藥敏試驗

將HPS接種于TSB培養(yǎng)基，37℃180r/min震蕩培養(yǎng)12h后，用滅菌棉簽沾取培養(yǎng)液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，待稍干后，用無菌鑷子將藥敏試紙片平貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 細菌形態(tài)及鏡檢特征

取病料接種于含5%新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基，置于含5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，共分離到細菌127株，純培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)有47株細菌為圓形、光滑濕潤、無色透明、直徑為1～2mm左右的菌落，鏡檢可見革蘭氏陰性短小桿菌，具有多種不同形態(tài)，從單個球桿菌到長的、細長的、絲狀的菌體。

3.2 培養(yǎng)特性觀察結(jié)果

將47株疑似菌純培養(yǎng)物進行培養(yǎng)特性觀察，發(fā)現(xiàn)均在麥康凱培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上不生長;在普通血平板上長成細小、針尖狀、半透明菌落；在含V因子血平板及含V因子LB培養(yǎng)基上長成灰白色、半透明、細小、露珠狀菌落，邊緣整齊、光滑、圓形、隆起，菌落直徑約為1.0mm。

3.3 衛(wèi)星試驗結(jié)果

疑似菌在綿羊鮮血平板上與金黃色葡萄球菌垂直水平線劃線，37℃培養(yǎng)24h后，呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”，并且在鮮血瓊脂平板上的菌落周圍不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

3.4 生化鑒定結(jié)果

表1 生化試驗結(jié)果

將疑似菌落接種于微量生化鑒定管，均出現(xiàn)表1所示結(jié)果。

3.5 PCR擴增反應結(jié)果

根據(jù)副豬嗜血桿菌16SrRNA序列設計引物經(jīng)PCR擴增的產(chǎn)物為822bp大小的片段，與預期擴增片段大小相符。

3.6 血清型鑒定結(jié)果

將分離到的47株HPS，通過瓊脂擴散試驗進行血清型分型，結(jié)果如表2所示。4型和5型最為流行，其次是13和14型，另有3株不能確定血清型。4型和5型血清型病料主要來自定南、龍南、全南3個縣，分別都是贛州地區(qū)生豬養(yǎng)殖規(guī)模較大的縣。

表2 血清型鑒定結(jié)果%

3.7 藥敏試驗結(jié)果

如表3所示，分離株對喹諾酮類藥物如諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等，以及頭孢拉定、卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素、羧芐青霉素敏感，但對紅霉素和壯觀霉素有抵抗力。

表3 藥敏試驗結(jié)果mm

4 討論

副豬嗜血桿菌病可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已經(jīng)成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)最重要的細菌性疾病之一。本試驗對贛州地區(qū)副豬嗜血桿菌的病原學、血清流行病學和耐藥性進行研究，為副豬嗜血桿菌病的基礎研究及該病的診斷、預防與控制奠定基礎。

經(jīng)常發(fā)生該病的豬場，應該重視管理方面的問題，實行“全進全出”的飼養(yǎng)制度，做到嚴格分群飼養(yǎng)。對規(guī)?；i場來講，分娩舍一定要采用小單元的飼養(yǎng)模式，采用“全進全出”的飼喂體系，舍內(nèi)保持合理的飼養(yǎng)密度，確保適宜的溫度和優(yōu)良的空氣質(zhì)量，嚴格禁止不同批次的豬只混養(yǎng)，減少、消除各類應激因素。由于HPS具有敗血癥的特征，發(fā)展迅速，且一周齡仔豬即可發(fā)病，因此提高母代的免疫力和天然的免疫力也是控制該病的關鍵。母豬接種后可使4周齡以內(nèi)的仔豬產(chǎn)生保護性免疫力。另外，在管理中可采取措施預先讓豬接觸無致病力的副嗜血桿菌株，以培養(yǎng)后來的有毒株刺激的抵抗力。

[1]蔡旭旺，陳煥春，劉正飛，等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2005（24）：55～58.

[2]白文彬，于康震.動物傳染病診斷學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，447～483.

[3]奧斯伯F，金斯頓R F，塞德曼T G，等.精編分子生物學試驗指南[M].顏子穎，王海林譯，北京：科學出版社，1998，39.

[4]OLIVEIRAS,GALNAI,PIJOAN.Development of a PCR test to diagnose haemophilus parasuis infections [J].Jvetdiagn Invest,2001,13（6）:495～501.