針刺對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響及其抗氧化應(yīng)激機(jī)制研究*

劉 健 ，高 婷 ，萬基偉 ，李銀虹 ，王 敏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點(diǎn)研究室，國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關(guān)系三級實(shí)驗(yàn)室，天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193）

針刺對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響及其抗氧化應(yīng)激機(jī)制研究*

劉 健1，高 婷2，萬基偉2，李銀虹2，王 敏3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法重點(diǎn)研究室，國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關(guān)系三級實(shí)驗(yàn)室，天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193）

[目的]觀察針刺人迎穴對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓的影響以及體內(nèi)活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的變化，探討針刺降壓的抗氧化應(yīng)激機(jī)制。[方法]將SHR隨機(jī)分為針刺組、模型組，以京都Wistar大鼠（WKY）作為血壓正常的對照組。針刺組取雙側(cè)人迎穴，施以捻轉(zhuǎn)手法，捻轉(zhuǎn)頻率為每分鐘120～160次，行針1min，每日針刺1次；模型組和正常組進(jìn)行與針刺組相同時間、相同程度的捉抓。每天針刺前后測量收縮壓和舒張壓。針刺4周后，取胸主動脈，用酶聯(lián)免疫法檢測ROS含量，硝酸還原酶法檢測NO含量，蛋白印跡法檢測eNOS蛋白表達(dá)。[結(jié)果]針刺4周后SHR收縮壓和舒張壓均較針刺前降低，均低于模型組，其中以收縮壓降低更為明顯。SHR胸主動脈的ROS含量高于WKY，而NO含量和eNOS蛋白表達(dá)低于WKY（P<0.05），針刺后ROS含量明顯降低，而NO含量明顯升高（P<0.05），eNOS蛋白表達(dá)亦有升高趨勢。[結(jié)論]針刺可降低SHR血壓，其機(jī)制可能與降低ROS和提高NO/eNOS含量，從而提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

高血壓；針刺；活性氧；一氧化氮；內(nèi)皮型一氧化氮合酶

高血壓病的發(fā)病機(jī)制及病理過程至今仍尚未完全闡明，近年來大量研究證明氧化應(yīng)激在高血壓病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[1]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加或抗氧化清除能力降低，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。已有學(xué)者證實(shí)原發(fā)性高血壓、高血壓危象患者，體內(nèi)血氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯升高，內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)顯著低于血壓正常者，并且與舒張性物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[2]；自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）是與人類原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制最接近的動物模型[3]，也存在著隨血壓升高，大鼠主動脈、心臟、腎臟的氧化應(yīng)激標(biāo)志物增高的事實(shí)[4]。針灸在降壓方面療效肯定[5]，前期研究也證實(shí)了針刺降壓的有效性[6]，但針刺降壓的機(jī)制研究較少，涉及到氧化應(yīng)激機(jī)制更是鮮有報(bào)道。本研究觀察針刺人迎穴對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓的影響以及胸主動脈活性氮（ROS）和一氧化氮（NO）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的變化，以期探討針刺降壓的抗氧化應(yīng)激機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 ROS酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒（加拿大HermesCriterion Biotechnology公司）、NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）、BCA蛋白定量測試盒（武漢博士德生物公司）、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（碧云天生物技術(shù)研究所）、β-actin單克隆抗體（天津潤泰科技生物有限公司）、大鼠抗羊一氧化氮合酶eNOS蛋白多克隆抗體（武漢博士德的生物有限公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金橋公司）、ECL顯影試劑盒（Santa Cruz公司）、生理鹽水等。

1.2 儀器 智能無創(chuàng)鼠尾動脈血壓測量儀（日本軟隆BP-98A）、瑞士Tecan Sunrice Remote酶標(biāo)儀、日本島津UV2501紫外分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad Mini-Protein3 system）、電泳儀、濕轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性SHR20只，WKY 10只，16周齡，體質(zhì)量190～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將20只SHR 大鼠（收縮壓≥180mmHg，1mmHg=0.133 kPa）采用Excel工作表自動生成的隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為針刺組和模型組，每組10只。將10只WKY大鼠作為血壓正常的正常組。

1.4 穴位選取及針刺方法 選取“人迎”為針刺穴位。根據(jù)人和大鼠解剖特點(diǎn)和人迎穴定位特點(diǎn)，以中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”作為參考，確定大鼠人迎穴定位：頸部三角區(qū)內(nèi)，當(dāng)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點(diǎn)，約當(dāng)頸總動脈分叉處，體表可觸及搏動，當(dāng)直刺時可見針柄隨動脈搏動而上下振動。固定大鼠，暴露雙側(cè)頸部人迎穴部位，選用華佗牌0.3mm×40mm毫針直刺人迎穴，深度2～3mm，見針柄隨動脈搏動而上下振動，為刺中穴位。施以捻轉(zhuǎn)手法，捻轉(zhuǎn)頻率為每次120～160次，行針1min，以節(jié)拍器輔助，便于掌握捻轉(zhuǎn)的頻率和時間。針刺組每天上午針刺1次，每周針刺5 d，休息2 d，共治療4周。模型組和正常組均不針刺，與人迎組在同一時間進(jìn)行相同抓取刺激。

1.5 血壓的測量 于每天針刺前和針刺后6 h，用動物智能無創(chuàng)血壓測試儀測量各組大鼠的尾動脈收縮壓和舒張壓。具體使用方法：1）測壓前確保動物室環(huán)境安靜、溫度適宜，打開血壓儀器系統(tǒng)預(yù)熱，壓力值設(shè)為220mmHg。2）打開鼠袋，將鼠網(wǎng)放入保溫筒，再將保溫筒放入鼠袋，確保合適。3）抓取大鼠，動作輕柔的將待測大鼠置于鼠袋內(nèi)，固定鼠袋，使尾巴暴露在外，將大鼠尾部穿過加壓感應(yīng)器，使加壓感應(yīng)器距尾根3～5 cm處。4）打開軟件，待大鼠安靜，尾動脈血管充分預(yù)熱擴(kuò)張，界面顯示動態(tài)血壓波形穩(wěn)定后開始測量血壓，連續(xù)測量2次，取平均值。前后兩次血壓值波動幅度不超過10%為度。

1.6 取材和指標(biāo)檢測 各組大鼠于治療結(jié)束后，用10%水合氯醛按3.5mL/kg體質(zhì)量的劑量麻醉大鼠，迅速開胸取胸主動脈，清除周圍的結(jié)締組織，放入凍存管中-80℃保存。檢測時取出組織，勻漿，按照試劑盒說明書，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測ROS，硝酸還原酶法檢測NO含量，蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blotting）法測定eNOS表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)的計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA)，兩兩比較時若方差齊者用LSD法，方差不齊者用Tamhane’ST2法；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，組間比較采用多個獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠4周后血壓變化 針刺前，針刺組和模型組的收縮壓、舒張壓均高于血壓正常的WKY（P<0.05）。針刺4周后，正常組的收縮壓和舒張壓均穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)；模型組的收縮壓和舒張壓隨周齡增長而升高；針刺組收縮壓與模型組比較明顯降低（P<0.05），而舒張壓與模型組比較有降低的趨勢，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但由于SHR血壓隨周齡增加而升高，故針刺在一定程度上能夠抑制SHR隨周齡而升高的舒張壓。若延長治療周期，推測舒張壓與模型組比較會出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1、表2。

表1 各組針刺前和4周后收縮壓比較（±s）Tab.1 Comparison of thesystolic blood pressure changes beforeacupunctureand after 4weeks in each group(±s)

表1 各組針刺前和4周后收縮壓比較（±s）Tab.1 Comparison of thesystolic blood pressure changes beforeacupunctureand after 4weeks in each group(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

mmHg組別 動物數(shù) 針刺前收縮壓 4周后收縮壓針刺組 10 177.75±23.29* 169.91±17.07#模型組 10 181.10±18.10* 189.22±20.39*正常組 10 122.80±16.24 123.65±17.72

表2 各組針刺前和4周后舒張壓比較（±s）Tab.2 Com parison of the diastolic blood pressure changes beforeacupuncture and after 4weeks in each group(±s)

表2 各組針刺前和4周后舒張壓比較（±s）Tab.2 Com parison of the diastolic blood pressure changes beforeacupuncture and after 4weeks in each group(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05。

mmHg組別 動物數(shù) 針刺前舒張壓 4周后舒張壓針刺組 10 128.89±16.43* 127.37±23.30模型組 10 125.90±16.20* 134.81±17.49*正常組 10 78.74±11.39 76.51±20.75

2.2 針刺對SHR胸主動脈ROS和NO含量的影響

模型組ROS含量明顯高于正常組（P<0.05），而NO含量明顯低于正常組（P<0.05）；針刺組ROS含量明顯低于模型組（P<0.05），而NO含量明顯高于模型組（P<0.05）。提示SHR體內(nèi)ROS含量明顯升高、NO含量明顯降低，針刺有降低ROS、提高NO的作用。見表3。

表3 各組大鼠胸主動脈ROS、NO含量的比較（±s）Tab.3 Com parison of ROSand NO contents in thoracic aorta in each group(±s)

表3 各組大鼠胸主動脈ROS、NO含量的比較（±s）Tab.3 Com parison of ROSand NO contents in thoracic aorta in each group(±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，與正常組比較，#P<0.05。

組別 動物數(shù) ROS（U/mg） N O（μmol/g）針刺組 6 1.14±0.07* 114.18±53.19*模型組 6 1.72±0.09# 48.04±19.91#正常組 6 1.38±0.17 144.51±38.76

2.3 針刺對SHR大鼠胸主動脈eNOS蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠胸主動脈eNOS蛋白含量較正常組偏低（P<0.05），針刺組eNOS蛋白表達(dá)雖較模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但仍較模型組有所升高。見圖1、表4。提示SHR體內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)明顯減少，針刺有提高其表達(dá)的趨勢。

圖1 eNOS蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of eNOS

表4 各組胸主動脈eNOS的蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Com parison of the of protein expression about eNOS in thoracic aorta in each group（±s）

表4 各組胸主動脈eNOS的蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Com parison of the of protein expression about eNOS in thoracic aorta in each group（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05。

組別 動物數(shù) 灰度值 eNOS/β-actin針刺組 6 122.15±28.88 0.74±0.01模型組 6 104.50±17.94 0.58±0.04*正常組 6 161.58±36.69 0.93±0.28

3 討論

本院石學(xué)敏院士創(chuàng)立了以人迎穴為主穴、有規(guī)范明確手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的針刺降壓方法。針刺人迎穴有明確的量學(xué)要求，根據(jù)臨床實(shí)踐，人迎穴采用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法第二定義中的補(bǔ)法操作（施用小幅度、高頻率捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，捻轉(zhuǎn)幅度小于90°；捻轉(zhuǎn)頻率為120～160 r/min）[7]。應(yīng)用此針法降壓在臨床上取得了良好效果[6,8]。本研究顯示，針刺可降低SHR隨周齡而升高的血壓，其中以收縮壓降低更為顯著。

氧化應(yīng)激加速高血壓病的發(fā)生發(fā)展，其作用的靶點(diǎn)是血管損害[9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在某些危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)下會產(chǎn)生大量的ROS，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂、破壞血管結(jié)構(gòu)、加速動脈硬化，從而引起血壓持續(xù)升高。O2-是ROS的主要來源，O2-本身具有縮血管功能，同時，在病理狀態(tài)下，多種氧化/抗氧化酶的活性增強(qiáng)/減弱，O2-的產(chǎn)生速率大于被清除的速率，就會造成ROS的蓄積，另一方面，過多的O2-可以與NO結(jié)合生成氧化亞硝酸鹽（ONOO-），使內(nèi)皮衍生性的NO生物利用度下降[10]，引起血管收縮，血壓升高。ROS參與高血壓血管損害的病理機(jī)制主要表現(xiàn)在參與血管重構(gòu)和損害血管內(nèi)皮依賴性舒張功能這兩個方面[11-12]。發(fā)生高血壓等病理變化時，eNOS出現(xiàn)功能障礙，產(chǎn)生O2-，使eNOS合成的NO的生物利用度會明顯降低，增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致或加重內(nèi)皮功能障礙，發(fā)生eNOS脫偶聯(lián)現(xiàn)象[13-14]，其促進(jìn)了高血壓的發(fā)展和血管并發(fā)癥的發(fā)生[15]。

NO是一種血管舒張因子，能迅速穿過生物膜，從內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞后，通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）濃度增加，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞松弛，血管擴(kuò)張，血壓下降。血管系統(tǒng)中eNOS是NO的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓病患者較正常人血清內(nèi)的NO含量釋放減少，在SHR大鼠主動脈中，NO生成減少，提示內(nèi)源性NO減少，導(dǎo)致血管收縮，可能是血壓持續(xù)升高的一個重要原因[16-17]。

本研究中，SHR胸主動脈中ROS含量升高、NO含量和eNOS蛋白表達(dá)減少，與血壓正常的WKY比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。針刺治療后，胸主動脈ROS含量降低，NO含量升高（P<0.05），eNOS表達(dá)亦有升高趨勢（P＞0.05）。研究結(jié)果提示SHR體內(nèi)氧化與抗氧化關(guān)系失衡，使機(jī)體內(nèi)ROS蓄積過多，同時eNOS表達(dá)量減少，降低了NO的合成能力。針刺降壓的機(jī)制之一可能是通過減少ROS含量，提高NO/eNOS含量，從而提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，減輕血管內(nèi)皮功能的損害，起到舒張血管作用，達(dá)到降壓目的。

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Effectsofacupuncturing on spontaneously hypertensive ratsblood pressure and antihypertensivemechanism

LIU Jian1,GAOTing2,WAN Ji-wei2,LIYin-hong2,WANGMin3
（1.Acupuncture Institute,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Acupuncture Encephalopathy Key Research Laboratory of the State Administration of TraditionalChinesemedicine,Three-level Laboratory ofDoseeffect relationship of the State Administration of TraditionalChineseMedicine,Tianjin Acupuncture Key Laboratory,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China;3.Acupuncture Department,the FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe the effects of acupuncture on spontaneously hypertensive rat(SHR)blood pressure,ROSand NO/eNOS,and research the antihypertensivemechanism from the perspective of resistancing to oxidative stress.[Methods]To separate the SHRs into acupuncture group and model group random ly,WKYs as normal blood pressure controlled group.To acupuncture group,acupuncturewith the twirlingmanipulation,frequency 120～160 times/min,lasting 1min.Modelgroup and normalgroup were treated by the same crawl stimulation.The systolic pressure wasmeasured before and after the treatmentevery day.The blood pressure wasmeasured before and after the treatmentevery day.After 4 weeks of treatment,all the ratswere decapitated and get the thoracic aorta.The contentof ROSand NO wasmeasured by ELISA method and nitrate reductive enzymatic.The eNOS protein expresswasmeasured by Western blotting.[Results]After4 weeksacupuncture,the both systolic and diastolic blood pressure of SHRwere lower than before,and lower thanmodel.Among them,the systolic blood pressure lowering wasmore apparent.The content of ROS in SHR was higher than WKY,NO and eNOSwas lower(P<0.05).Afteracupuncture,the contentofROSwas lowerand NOwashigher(P<0.05),and eNOSprotein wasalso rising trend compared withmodelgroup.[Conclusion]Acupuncture can reduce SHR systolic and diastolic blood pressure and itsmechanismsmay be related to reduce the contentofROSand increase the contentofNO/eNOS,thus improve theantioxidantcapacity.

hypertension;acupuncture;reactive oxygen species;nitric oxide;endothelialnitric oxide synthase

R544.1

A

1672-1519（2015）08-0488-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.08.12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202738）；2011年度教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（13JCZDJC31700）；天津市衛(wèi)生局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目（11036）。

劉 ?。?974-），女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)獒槾讨委熌X血管疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。

2015-02-25）

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