瞄準(zhǔn)DNA根治疾病

劉衛(wèi)

生命的核心是遺傳物質(zhì)，也即脫氧核糖核酸（DNA），人的DNA包裹在細(xì)胞核中，一個(gè)人的DNA包含了其所有的生命和遺傳信息?，F(xiàn)在，研究人員已經(jīng)能通過對DNA編（剪）輯來根治人的疾病，甚至可能操控生命。

編輯DNA的利器

編輯DNA需要工具，這些工具實(shí)際上就是一些蛋白酶，它們可以在特定的位置切割和編輯基因，因此也可以視它們?yōu)榛蚣舻丁，F(xiàn)在，最厲害的基因剪刀或基因編輯器是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，被稱為第三代基因編輯技術(shù)。CRISPR的全稱是，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列，最初是研究人員在一些細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的，它們是一系列成簇排列的DNA序列。

Cas是Caspase的簡稱，全稱是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。它是一組對底物天門冬氨酸部位有特異水解作用、活性中心含半胱氨酸的蛋白酶。目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族共有13個(gè)，其中起凋亡啟動(dòng)子作用的有Cas8、9、10，起凋亡效應(yīng)子作用的有Cas3、6、7。從本質(zhì)上來看，酶也是一種蛋白。Cas蛋白與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。

問題的關(guān)鍵是，CRISPR與Cas9結(jié)合能準(zhǔn)確切割和編輯基因。研究人員早就發(fā)現(xiàn)，CRISPR與很多能夠侵入細(xì)菌的噬菌體DNA序列相同。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體DNA的這些序列在被轉(zhuǎn)錄成為核糖核酸（RNA）后，就成為靶向RNA（gRNA），能夠和細(xì)菌產(chǎn)生的Cas蛋白形成復(fù)合體，并引導(dǎo)Cas蛋白。當(dāng)復(fù)合體檢測到入侵的噬菌體DNA和靶向RNA序列一致時(shí)，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達(dá)到防御的目的。所以，Cas蛋白實(shí)際上就是一把基因剪刀，可以用來對抗入侵的病毒及外源性DNA。

當(dāng)CRISPR與Cas9結(jié)合成為CRISPR-Cas9系統(tǒng)時(shí)，就成為一種有目的和能精確控制的基因剪刀。Cas9來自產(chǎn)膿鏈球菌，現(xiàn)在研究人員對它進(jìn)行了改造，將編碼Cas9蛋白的基因序列及其附屬元件共同制造成為一個(gè)單一的載體。研究人員只需針對需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列，插入CRISPR-Cas9載體的特定部位，在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，人工構(gòu)建的導(dǎo)向RNA就能指導(dǎo)Cas9蛋白切割宿主細(xì)胞特定的DNA序列，也就既能從基因上根治疾病，也可能從基因上操控生命。

3種基因剪刀的比較

CRISPR-Cas9系統(tǒng)現(xiàn)在顯示出最神奇作用的是，它可以在DNA的分子水平根治疾病，治療一系列人類尚不能征服的頑癥，如艾滋病、瘧疾。原因在于，CRISPR-Cas9系統(tǒng)比第一代基因編輯器鋅指核酸酶（ZFN）系統(tǒng)和第二代基因編輯器轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）系統(tǒng)有更多和更大的優(yōu)點(diǎn)。

ZFN和TALEN都是嵌合體，都是由經(jīng)過設(shè)計(jì)的、序列特異性的DNA結(jié)合元件和非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)結(jié)合而成。ZFN和TALEN都可以對DNA進(jìn)行各種切割和遺傳修飾，其作用機(jī)制都是先對DNA雙鏈分子進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口，然后激活細(xì)胞內(nèi)的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制（是一種非保真的、容易出現(xiàn)遺傳突變的修復(fù)機(jī)制），或者激活同源重組修復(fù)機(jī)制（是一種高保真的修復(fù)機(jī)制，不容易出現(xiàn)突變），利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制對DNA進(jìn)行編輯和遺傳修飾。

但是，ZFN和TALEN在基因序列的數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可作用的編輯位點(diǎn)，因而大大限制了它們的使用范圍。但CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可編輯位置更多，理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可以用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行編輯的位置，因此，這一技術(shù)能對任何一種基因進(jìn)行編輯操作。

更重要的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的安全性更強(qiáng)，因?yàn)樗梢圆磺袛郉NA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后非同源DNA末端連接造成的染色體變異風(fēng)險(xiǎn)，也即基因突變，從而精確地去除致病基因。

現(xiàn)在，對難以治愈的艾滋病和癌癥就可以利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來治療，因?yàn)檫@把基因剪刀可以剪掉隱藏在人體免疫細(xì)胞中的艾滋病病毒和去除引起癌癥的病毒的基因。

根治艾滋病

美國艾滋病專家于2014年7月10日宣布，曾被認(rèn)為“功能性治愈”的“密西西比嬰兒”在停藥兩年多后體內(nèi)再次檢測出艾滋病病毒（HIV）。盡管專家還不清楚為何“密西西比嬰兒”體內(nèi)的HIV會(huì)復(fù)活，但是根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，HIV會(huì)在人體的腸道等多種部位和組織中藏匿起來，并形成病毒儲(chǔ)存庫，進(jìn)入休眠狀態(tài)。一旦外部環(huán)境適宜，例如，沒有藥物的攻擊和抑制，病毒休眠體就會(huì)源源不斷地產(chǎn)生新的HIV。

對此，研究人員認(rèn)為，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以精確清除隱藏在人體細(xì)胞中的1型艾滋病病毒（HIV-1是感染大部分人的艾滋病病毒）的基因，從而根治艾滋病。美國天普大學(xué)和中國四川大學(xué)華西醫(yī)院的研究人員共同設(shè)計(jì)了一種長度為20個(gè)核苷酸的靶向RNA，能夠引導(dǎo)到HIV-1的DNA，然后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來根除HIV-1。

靶向RNA的目標(biāo)是HIV-1的3’端和5’端長末端重復(fù)序列（LTR），LTR就位于HIV-1基因組兩端。在靶向RNA到達(dá)HIV-1兩端的LTR后，Cas9蛋白就可以剪去HIV-1基因組的9709個(gè)核苷酸（核心基因）。同時(shí)，為了避免靶向RNA傷及患者自身細(xì)胞的基因組，研究人員挑選了人類DNA編碼序列中不會(huì)出現(xiàn)的核苷酸序列，以避免CRISPR-Cas9系統(tǒng)脫靶和損傷自身的DNA。

人體被感染細(xì)胞中的HIV-1的一些核心基因后，HIV就不能在人體細(xì)胞中藏匿和復(fù)制了，同時(shí)人體細(xì)胞中的基因會(huì)自動(dòng)修復(fù)和復(fù)制，把細(xì)胞DNA中被切割的那部分修復(fù)好，恢復(fù)成無HIV的細(xì)胞。

現(xiàn)在，這種基因組編輯清除HIV-1的效果在幾種感染了HIV-1的細(xì)胞類型中得到驗(yàn)證，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。T細(xì)胞和單核細(xì)胞是HIV-1感染人體的主要的細(xì)胞類型，因此，清除這些細(xì)胞中的HIV-1基因也就能徹底根治艾滋病。

利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除人體細(xì)胞中隱藏的HIV是永久性治愈艾滋病的方法，當(dāng)然，這種療法目前不僅復(fù)雜和費(fèi)用高昂，而且還需要進(jìn)行安全性的試驗(yàn)。因此，還需要一些時(shí)間才能成熟起來。

治療癌癥

癌癥的產(chǎn)生有多種原因，其中之一是病毒感染導(dǎo)致癌癥，例如宮頸癌。現(xiàn)在，研究人員能明確的是，人乳頭瘤病毒（HPV）能導(dǎo)致宮頸癌、頭頸癌和其他癌癥，而且這種病毒引起了幾乎所有的宮頸癌和大約一半的頭頸癌。因此，可以通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)刪除人乳頭瘤病毒的部分關(guān)鍵基因而使其失去致病性，從而預(yù)防和治療宮頸癌。

美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分子遺傳學(xué)教授卡倫等人利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)選擇性地切除兩個(gè)導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞生長和存在的病毒基因，從而使癌細(xì)胞自我毀滅，根治宮頸癌。

根據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理，Cas9這種DNA切割酶能夠與靶向RNA結(jié)合，靶向RNA則能夠告訴Cas9切割哪一部分基因。因此，卡倫等人以誘發(fā)宮頸癌的人乳頭瘤病毒的兩個(gè)致癌基因E6和E7為目標(biāo)，生成了靶向RNA，然后再添加Cas9蛋白，成為一個(gè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)混合物（抗病毒的基因工程混合物）。

隨后，研究人員把這種以E6和E7基因?yàn)槟繕?biāo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿中感染宮頸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種靶向CRISPR-Cas9系統(tǒng)讓癌細(xì)胞立即停止生長。作為對照，用隨機(jī)靶向RNA制成的CRISPR-Cas9系統(tǒng)感染宮頸癌細(xì)胞并未阻止癌細(xì)胞生長。

進(jìn)一步的分子水平的探索表明，以E6、E7基因?yàn)榘邢虻腃RISPR-Cas9系統(tǒng)切除E6和E7基因后，可以促進(jìn)p53蛋白的功能，p53被稱為基因組的守護(hù)者，當(dāng)它感覺到哪里出現(xiàn)問題時(shí)，可以打開細(xì)胞中的自殺通路。當(dāng)CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶定E6和E7并清除它們時(shí)，就可以讓p53恢復(fù)其正常功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡（凋亡）。

根據(jù)同樣的原理，美國麻省理工學(xué)院的杰克斯等人瞄準(zhǔn)肺腺癌（占所有肺癌的40%）的致癌基因Kras，制作成特異性的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，同樣抑制了腫瘤的生長。

【責(zé)任編輯】張?zhí)锟?/p>