王一恬,張玲,沈微,楊海麟
1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)
低聚果糖(Fructooligosaccharide,F(xiàn)OS)是一類重要的低聚糖,進入人體消化道后,不會被膽汁、胃酸、消化酶等分解吸收,可直達大腸中。腸道益生菌如雙歧桿菌、嗜酸性乳酸桿菌等可選擇性利用低聚果糖,獲得快速、大量繁殖,因此它是腸道益生菌的增殖因子[1-2]。果 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 (fructosyltransferase,EC 2.4.1.9,縮寫FTase)可催化蔗糖分子果糖基上的β-(2,1)糖苷鍵,結(jié)合1~3個果糖基,生成低聚果糖。低聚果糖主要包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)及其混合物等。果糖基轉(zhuǎn)移酶的主要來源包括兩方面:1)植物,如黑麥草、洋蔥等[3-4];2)微生物,如真菌、細菌等[5-7]。植物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶存在低含量等缺點,在低聚果糖工業(yè)生產(chǎn)中未被大規(guī)模采用。近年來,多種微生物(如絲狀真菌、酵母、節(jié)桿菌等)來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶被逐步發(fā)現(xiàn)并得到研究,但主要集中在對產(chǎn)酶微生物的篩選、酶純化、酶學(xué)性質(zhì)等初步研究[8-10]。本文采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR),獲得黑曲霉(Aspergillus niger)YZ59的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因成熟酶區(qū)域(不含內(nèi)含子)。采用食品級表達宿主釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W3031A,成功異源表達了A.niger YZ59果糖基轉(zhuǎn)移酶。純化后,對其酶學(xué)性質(zhì)進行分析與討論。該研究對果糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達及高純度低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。
A.niger YZ59(CICIM F0901)保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心;S.cerevisiae W3031A、大腸桿菌(Escherichia coli)宿主菌株JM109、質(zhì)粒pYX212為本研究室保藏,其他質(zhì)粒均為實驗中構(gòu)建。
LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10;
SC-Ura培養(yǎng)基(g/L):酵母氮基6.7、葡萄糖20、亮氨酸 0.12、色氨酸 0.12、組氨酸 0.12、腺嘌呤0.12、瓊脂 15;
YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20。
采用反轉(zhuǎn)錄酶III試劑盒(Invitrogen 18080-051)進行RT-PCR,獲得A.niger果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA。將已獲得的cDNA作為進一步PCR的模板。PCR引物序列為:上游5’-CCGGAATTCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3’;下游5’-CGCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGAGACTGACGATCCGGCCA-3’。引物兩端的限制性酶切位點(下劃線)分別為:EcoR I與BamH I。
PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pYX212均采用限制性內(nèi)切酶EcoR I與BamH I進行酶切。采用連接酶,將酶切后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pYX212進行連接,獲得重組質(zhì)粒pYX212-fwt,測序驗證。采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pYX212-fwt轉(zhuǎn)化宿主S.cerevisiae W3031A,利用尿嘧啶缺陷型平板(SC-Ura培養(yǎng)基)篩選,獲得產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt。
在搖瓶(250 mL)中對重組菌 S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt進行培養(yǎng),30℃發(fā)酵48 h后,4℃下,8 000×g離心10 min,獲得菌體細胞。用相同體積的磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 5.5)洗滌菌體細胞3次,再加入等體積的緩沖液混勻后,采用超聲破碎儀破碎細胞。4℃下,10 000×g離心10 min,獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
果糖基轉(zhuǎn)移酶的測定是通過HPLC方法測定反應(yīng)體系中蔗果三糖(GF2)的含量[11-12]。1個單位的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活定義為:每分鐘生成1 μmol GF2需要的酶量。
將“酶液制備”獲得的含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液,采用0.2 μm的膜過濾去除雜質(zhì)。由于果糖基轉(zhuǎn)移酶的C端含有His標(biāo)簽,實驗中采用Ni2+柱純化過濾后的酶液,蛋白純化儀為AKTA(GE,USA)。緩沖液A為含有20 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)。緩沖液B為含有250 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)。流速為1.0 mL/min。基于線性洗脫(0~100% 緩沖液B),收集目的樣品。
酶最適溫度測定時的條件為:溫度范圍為30~70℃、底物為蔗糖、100 mmol/L磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 5.5)。在不同溫度下測定的最高酶活力設(shè)為100%。研究過程中,分析了酶在40、50、60℃條件下的溫度穩(wěn)定性。在各溫度條件下,處理前的初始酶活力設(shè)為100%。
酶的最適pH是在不同pH條件下進行分析的,如pH3.0~8.0(磷酸-檸檬酸緩沖液,100 mmol/L)。在不同pH條件下測定的最高酶活力設(shè)為100%。酶pH穩(wěn)定性測定的前處理條件為:不同pH緩沖液、25℃保溫24 h。采用的緩沖液為:磷酸-檸檬酸緩沖液(100 mmol/L,pH 3.0~8.0)、磷酸緩沖液(100 mmol/L,pH 8.0~9.0)、甘氨酸-NaOH 緩沖液(100 mmol/L,pH 9.0~11.0)。在不同pH緩沖液處理條件下,測得的最高殘留酶活力設(shè)為100%。
酶動力學(xué)參數(shù)測定條件為:磷酸-檸檬酸緩沖液(100 mmol/L,pH 5.5)、底物為蔗糖。底物濃度范圍為20~250 g/L。動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax均采用Lineweaver-Burk作圖法進行計算。
為分析金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響,5 mmol/L 不同金屬離子(K+、Li+、Ba2+、Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、NH4+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+)分別添加到果糖基轉(zhuǎn)移酶酶反應(yīng)體系中。以不添加金屬離子條件下測定的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力為100%。
通過RT-PCR方式,獲得來源于A.niger YZ59(CICIM F0901)的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA。以該cDNA為模板,進一步通過PCR方式獲得不含內(nèi)含子的果糖基轉(zhuǎn)移酶成熟序列fwt。采用限制性內(nèi)切酶EcoR I與BamHI進行酶切,純化后,與質(zhì)粒pYX212連接,獲得重組質(zhì)粒pYX212-fwt(圖1)。
圖1 重組質(zhì)粒pYX212-fwt的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pYX212-fwt
將重組質(zhì)粒 pYX212-fwt轉(zhuǎn)化 S.cerevisiae W3031A,基于尿嘧啶缺陷型平板篩選,獲得產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt。提取重組菌 S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt的基因組,以其為模板進行PCR驗證,獲得已重組果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的陽性S.cerevisiae重組子。
將陽性S.cerevisiae重組子接種YPD培養(yǎng)基,30℃發(fā)酵56 h(圖2)。隨著發(fā)酵的逐步進行,果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量逐漸增加,當(dāng)發(fā)酵至48 h時,酶活達到最大,為19.8 U/mL。同時,隨著發(fā)酵的不斷進行,重組S.cerevisiae的菌體濃度也逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵至48 h時,菌體濃度達到最大,OD600=3.2。果糖基轉(zhuǎn)移酶也有在其他非食品級表達宿主中進行異源表達的報道。例如,王玉海等將來源于米曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在E.coli BL21(DE3)中實現(xiàn)了異源表達,25℃條件下,1.0 μmol/mL異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后,果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達59.0 U/g[13]。
圖2 重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt產(chǎn)酶曲線Fig.2 Time profiles of FWT production by recombinant S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt
如圖3A所示,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適反應(yīng)溫度為55℃。當(dāng)反應(yīng)溫度低于55℃時,隨著溫度的逐漸升高,F(xiàn)WT的酶活力逐漸增加。在最適反應(yīng)溫度(55℃)條件下,F(xiàn)WT的酶活力是30℃下酶活力的2.3倍。但高于55℃時,隨著反應(yīng)溫度的逐漸升高,F(xiàn)WT的酶活力迅速降低。70℃時,F(xiàn)WT的酶活力僅為55℃時酶活力的25.4%。對于果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的熱穩(wěn)定性,分別分析了酶在40、50、60℃下的穩(wěn)定性(圖3B)。在40℃下,處理60 min,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT基本不失活(酶活力殘留95%),這說明其在該溫度條件下穩(wěn)定。在50℃下,處理60 min,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力殘留約為60%,這說明其在該溫度條件下也較穩(wěn)定。但果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在60℃下,隨著處理時間的延長,酶活力迅速下降,甚至完全失活。由以上結(jié)果可以看出,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有良好的耐熱性。據(jù)報道,來源于米曲霉(A·oryzae)ZZ-01的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT較果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適反應(yīng)溫度偏低10℃,為45℃[8]。
圖3 溫度對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity and stability of FWT
果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適pH為5.5(圖4A)。當(dāng)pH<5.5時(3.0~5.5),隨著pH值的增加,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的相對酶活力逐漸增大。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在pH 5.5條件下的酶活力為pH 3.0條件下酶活力的4倍。但當(dāng)pH5.5時,隨著pH值的增加,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的相對酶活力迅速降低。如圖4B所示,分析了果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在pH 2.0~11.0條件下的穩(wěn)定性。在pH 6.0條件下,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT最為穩(wěn)定。在pH 4.0~9.0條件下,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的穩(wěn)定性較高(酶活殘留90%)。由此可確定,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有較寬的pH穩(wěn)定范圍。據(jù)報道,洋蔥來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶FST-1在pH低于或高于5.5時,酶活力迅速降低,甚至完全失活[4]。
圖4 pH對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the activity and stability of FWT
基于Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,以蔗糖為反應(yīng)底物,分別對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax進行分析。如圖5所示,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的Km值和Vmax值分別為169.5 g/L和0.7 g/(L·min)。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的kcat值和kcat/Km值分別為9.8 ×103min-1和57.8 L/(g·min)。
圖5 果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plots for using sucrose as substrate by FWT
為了分析金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力的影響,測定了5 mmol/L濃度下不同金屬離子(K+、Li+、Ba2+、Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、NH4+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+)對酶活力的影響關(guān)系。如圖6所示,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT可顯著被Ni2+和Mg2+激活。添加5 mmol/L Ni2+和Mg2+時,果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的酶活力分別為對照的112.3%和106.3%。同時,5 mmol/L K+和Fe3+也對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT有一定的激活作用。5 mmol/L Ba2+和Cu2+對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有顯著的抑制作用。金屬離子可以影響酶結(jié)構(gòu)的正確折疊,進而影響酶的酶活力。不同金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力具有不同的激活或抑制作用。例如,Ca2+可激活來自萵苣的果糖基轉(zhuǎn)移酶,但其活性卻受Zn2+和 Cu2+的抑制[14]。
圖6 金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ions on the activity of FWT
本研究通過RT-PCR獲得了A.niger來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因,成功在S.cerevisiae中實現(xiàn)了異源表達,并對純化后酶學(xué)性質(zhì)進行了測定、分析。果糖基轉(zhuǎn)移酶在S.cerevisiae中無需誘導(dǎo)即可進行異源表達,發(fā)酵48 h后,最高酶活力可達19.8 U/mL。對該重組果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn),酶的最適反應(yīng)溫度為55℃,酶在低于50℃的條件下穩(wěn)定。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適pH為5.5,具有較寬的pH穩(wěn)定范圍。果糖基轉(zhuǎn)移酶 FWT的 Km、Vmax、kcat、kcat/Km分別為 169.5 g/L、0.7 g/(L·min)、9.8×103min-1、57.8 L/(g·min)。Ni2+和 Mg2+可顯著激活果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT。S.cerevisiae作為食品級表達宿主,具有食品安全等優(yōu)點,后期將對S.cerevisiae高效生產(chǎn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶進行進一步調(diào)控與優(yōu)化研究。
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