華根霉細(xì)胞總蛋白及膜蛋白雙向電泳優(yōu)化體系的建立*

郭月，王棟 ，徐巖

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物及應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫，214122)

絲狀真菌作為重要的工業(yè)微生物，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品和現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用［1－4］。但是，由于絲狀真菌生理及其代謝的復(fù)雜性，目前對其相關(guān)代謝和調(diào)控機制的認(rèn)識尚不充分，難以進行有效的工業(yè)生產(chǎn)控制［5－6］。隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)的進步，通過蛋白質(zhì)組學(xué)在分子水平研究絲狀真菌的內(nèi)在代謝和調(diào)控機制成為可能。它能直觀反映出蛋白質(zhì)表達量的變化，可獲得大量與真菌代謝調(diào)控及應(yīng)激表達相關(guān)的蛋白信息，已在絲狀真菌研究中得到了應(yīng)用［7－11］，為深入研究真菌的代謝調(diào)控機制提供理論根據(jù)。雙向電泳技術(shù)(2-DE)因其高通量、高分辨率、快速、簡單等優(yōu)點成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心手段。通過優(yōu)化樣品制備和操作條件，獲得高質(zhì)量、可重復(fù)的2-DE圖譜，是進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)。由于蛋白質(zhì)樣本的類型和來源、所處的狀態(tài)以及實驗?zāi)康暮鸵蟾鞑幌嗤壳安]有一個通用的制備方法［12］。此外，在研究真菌代謝及蛋白分泌的過程中，除了大量的胞內(nèi)蛋白，真菌細(xì)胞中40%的蛋白是整合在生物膜上的，具有重要的生理功能［13］，整合分析膜結(jié)合蛋白質(zhì)，對于微生物代謝機理研究也至關(guān)重要。并且由于膜蛋白本身疏水性強、水溶性差、豐度低等特點，使得膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較為困難［14－17］。為此，許多研究者致力于膜蛋白質(zhì)提取方法、增溶劑選擇及凝膠電泳體系等方面的研究，使2-DE圖譜上能夠分離得到更豐富的膜蛋白，以用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

由于樣品的制備效果顯著影響著雙向電泳的結(jié)果［18］，針對不同樣品可優(yōu)化的可重復(fù)的操作條件也需要不斷的摸索［19］，建立優(yōu)化的雙向電泳體系是蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)。由于根霉屬微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)胞裂解相對其他屬菌株較困難，因此高效的裂解方法對于總蛋白及膜蛋白的提取和2-DE圖譜的獲得至關(guān)重要。目前針對真菌，細(xì)胞總蛋白樣品制備的常用方法包括機械法和化學(xué)法裂解細(xì)胞獲取蛋白，其中機械法包括液氮研磨法及高速珠磨法，化學(xué)裂解法包括在強堿或SDS存在下煮沸細(xì)胞，或者利用含有高濃度的尿素硫脲及表面活性劑配方中裂解細(xì)胞獲取蛋白［20－22］。其中對于絲狀真菌，采用機械法和化學(xué)裂解法相結(jié)合效果較好［22］;對于膜蛋白，目前通用的樣品制備方法不多，一般采用膜蛋白提取試劑盒或者利用表面活性劑等進行提取。ReadyPrepTMProtein Extraction Kit膜蛋白提取試劑盒是一種基于提取全細(xì)胞蛋白，再經(jīng)過兩相分層提取膜蛋白的試劑盒，已報道用于酵母、細(xì)菌、植物及動物組織膜蛋白的提?。?3－25］。Hama［26］和 Teng［27］也提出了根霉膜蛋白的提取方法。

華根霉(Rhizopus chinesis)CCTCC M201021，是從我國傳統(tǒng)釀造食品白酒大曲中分離得到的絲狀真菌，在傳統(tǒng)釀造過程中具有重要的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)該菌生產(chǎn)的膜結(jié)合脂肪酶具有較強的有機相酯合成活性［28］，可用于脂肪酶的工業(yè)生產(chǎn)。但是，由于根霉微生物的復(fù)雜性，其生理及發(fā)酵代謝機制尚不清楚，難以在傳統(tǒng)釀造及現(xiàn)代發(fā)酵過程中進行有效控制。因此，從分子水平入手，解析此類微生物的生理及發(fā)酵代謝機制，是一項極具意義與挑戰(zhàn)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為此類研究提供了有效的手段［7－11］。本研究通過比較華根霉細(xì)胞總蛋白(全細(xì)胞蛋白)及膜蛋白的不同提取方法用于雙向電泳研究，旨在建立優(yōu)化的雙向電泳條件，獲得重復(fù)性好、分辨率高、無明顯條紋、具有更多蛋白信息的華根霉全細(xì)胞蛋白及膜蛋白二維圖譜，為華根霉及相關(guān)微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種:華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

孢子斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯－葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨40 g/L，一水合麥芽糖10 g/L，橄欖油34 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，自然 pH。

1.1.2 試劑

IPG膠條(pH 3～10線性/pH 3～10非線性，24 cm)、兩性電解質(zhì) Bio-Lyte(pH 3～10)、礦物油、ReadyPrepTMProtein Extraction Kit為 Bio-Rad公司產(chǎn)品。二硫蘇糖醇(DTT)、溴酚藍、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、硫脲、碳酸氫銨(NH4HCO3)購自Sigma公司。蛋白測定試劑盒、低熔點瓊脂糖、尿素、蛋白酶抑制劑、甲叉雙丙烯酰胺/丙烯酰胺溶液、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸(CHAPS)、碘乙酰胺(IAA)、考馬斯亮藍G-250為上海生工產(chǎn)品。其他試劑均為分析純試劑，購自國藥集團試劑公司。

裂解液［29］:7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、40 g/L CHAPS、10 mg/mL DTT。

1.1.3 主要儀器

EttanTMIPGphor 3等電聚焦儀、EttanTMDALT Six垂直電泳系統(tǒng)、Image Scanner掃描儀，均為美國GE公司產(chǎn)品;立式冷凍離心機(3K15)，為德國Sigma公司;Mini-BeadBeater 16，美國Biospec公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)與制備

孢子培養(yǎng):接種孢子斜面培養(yǎng)基，40℃下培養(yǎng)72 h。

孢子懸浮液的制備:用無菌生理鹽水將生長于馬鈴薯－葡萄糖瓊脂斜面的成熟華根霉孢子洗下，經(jīng)兩層擦鏡紙過濾后制成孢子懸浮液，使用血球計數(shù)板計數(shù)，置于4℃待用。

菌體發(fā)酵培養(yǎng):孢子懸浮液接種量5×107個/L，接種到20 mL培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，培養(yǎng)66 h。

菌體制備:收集發(fā)酵成熟的菌體，超純水洗3次。稱取濕菌體質(zhì)量，將濕菌體與玻璃珠以1∶3質(zhì)量比混合后液氮研磨至粉末狀備用。

1.2.2 細(xì)胞總蛋白提取

采用機械法和化學(xué)裂解法相結(jié)合的方法，利用不同的提取液進行全細(xì)胞蛋白提取。

裂解液提取細(xì)胞總蛋白［29］:根據(jù)文獻略有改動，將超聲破碎改為了機械振蕩破碎，具體操作如下:裂解液1 mL，加入10 μL蛋白酶抑制劑(Protein Cocktail for fungi)和兩性電解質(zhì)Bio-Lyte?；旌暇鶆蚝蠹尤胍旱心サ牟Ａе榕c菌體的混合物0.8 g，渦旋混勻后置于mini beads beater破碎儀破碎10 min(30 s破碎，30 s冰浴)。破碎后的固液混合物于4℃放置2 h，放置期間每0.5 h拿出渦旋2 min。12 000 r/min 4℃ 離心30 min，上清即為細(xì)胞總蛋白溶液。

ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取細(xì)胞總蛋白:按照說明書操作，操作終止于兩相分層前。具體操作如下:稱取0.5 g液氮研磨后菌體與玻璃珠的混合物，加入0.5 mL的 Buffer M1，渦旋混勻后置于mini beads beater破碎10 min(30 s破碎，30 s冰浴)。加入0.5 mL的Buffer M2，冰水浴，每隔60 s渦旋混勻60 s，重復(fù)5次，再冰水浴1 h，得到的固液混合物12 000 r/min 4℃ 離心30 min，上清液即為細(xì)胞總蛋白溶液。

1.2.3 膜蛋白提取

ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取膜蛋白:由于該試劑盒可進一步提取膜蛋白，將1.2.1中試劑盒提取細(xì)胞總蛋白溶液置于37℃保溫30 min，每隔10 min漩渦振蕩30 s;室溫下，12 000 r/min離心5 min。下層即為提取的膜蛋白。

曲拉通X-100提取華根霉(Rhizopus chinensis)膜蛋白［26－27］:將發(fā)酵培養(yǎng) 66 h的華根霉菌體，研缽研磨并稱重，丙酮與菌體以10∶1(體積質(zhì)量比)的比例混合，置于磁力攪拌器上攪拌20 min洗去油脂，抽濾獲得菌體干粉;以10∶1的體積質(zhì)量比加入濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.2)，于4℃下磁力攪拌20 min，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復(fù)以上操作3次;加入與上述磷酸緩沖液等體積的0.1% 的 Triton X-100，4℃下磁力攪拌器攪拌20 min，4℃ 10 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復(fù)上述操作1次;加入上述等體積的1.5% 的Triton X-100，4℃磁力攪拌4 h，4℃ 10 000 r/min離心30 min，上清液即為膜蛋白溶液。

1.2.4 電泳樣品預(yù)處理

TCA/丙酮沉淀蛋白:獲得的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入10倍體積的10%TCA/丙酮溶液，－20℃沉淀過夜，4℃ 12 000 r/min離心30 min，棄上清液;用等體積的丙酮懸浮洗滌沉淀，－20℃放置1 h，4℃12 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復(fù)3次。得到沉淀的蛋白質(zhì)，揮發(fā)掉丙酮后，即得到蛋白樣品。

蛋白定量:將蛋白沉淀溶于上樣水化液(7 mol/L尿素、2 mol/L 硫脲、40 g/L CHAPS、2 g/L 的 Bio-Lyte、65 mmol/L DTT、0.02 g/L 溴酚藍)中，4 ℃放置3 h，每0.5 h漩渦振蕩5 min(30 s冰浴，30 s振蕩)，4℃12 000 r/min離心30 min，使用非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 雙向電泳

操作過程按照美國GE公司的《雙向電泳操作手冊》進行，采用24 cm、pH 3～10的膠條(線性/非線性)，上樣體積 450 μL，細(xì)胞總蛋白上樣量 1 080 μg，膜蛋白上樣量600 μg，20℃被動水化12 h。轉(zhuǎn)向等電聚焦，采用電壓逐步優(yōu)化方案優(yōu)化等電聚焦程序，等電聚焦結(jié)束后立即進行膠條平衡，然后以恒功率進行二向SDS-PAGE，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%丙烯酰胺凝膠，當(dāng)溴酚藍跑到凝膠底部時停止電泳，采用改良的考馬斯亮藍G-250染色法進行染色。GE公司的凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)Image Master Lab Scan掃描脫色后的凝膠，利用Bio-Rad公司的PDQuest 8.0.1軟件分析處理圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 華根霉細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜的建立

本研究首先針對細(xì)胞總蛋白，利用兩種細(xì)胞總蛋白提取方法，ReadyPrepTMProtein Extraction Kit與普通的裂解液提取法進行了華根霉細(xì)胞總蛋白的提取，用于2-DE分析。對兩種提取方法提取細(xì)胞總蛋白的雙向電泳效果作了比較，兩種方法提取的細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜如圖1所示。

由圖1可見，采用試劑盒提取的細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜分辨率較高，較清晰，橫縱條紋較少，無拖尾現(xiàn)象。對獲得的二維圖譜用PDQuest 8.0.1軟件進行分析，結(jié)果如圖2所示。試劑盒提取的細(xì)胞總蛋白在2-DE圖譜上的蛋白點數(shù)可以覆蓋裂解液提取得到蛋白點的86.1%，表明試劑盒可以提取大部分裂解液提取的細(xì)胞總蛋白點。此外，試劑盒提取的細(xì)胞總蛋白點比裂解液提取得到的蛋白點多了95個，說明試劑盒提取華根霉細(xì)胞總蛋白的效果較好，獲得的2-DE圖譜更加理想，可以得到更多的蛋白種類信息。

圖1 不同提取方法華根霉細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜Fig.1 2-DE maps of Rhizopus chinesis total protein extracted by different extraction methods

圖2 兩種提取方法得到的2-DE圖譜蛋白點差異Fig.2 Difference of protein points on 2-DE maps by different extraction methods

預(yù)制膠條pH值范圍也是影響雙向電泳2-DE圖譜結(jié)果的重要因素之一。寬pH值范圍的IPG膠條，對于蛋白的覆蓋率大，但是分辨度相對較低，而窄pH值范圍的IPG膠條，雖然可以提高分辨率及靈敏度，但是會有部分蛋白丟失［30］。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，華根霉細(xì)胞總蛋白點主要集中在pH 4～7之間，在堿性端也有一些蛋白點。為了使蛋白點能夠在較少損失的前提下，實現(xiàn)更有效的分離，獲得分辨度高的理想2-DE圖譜，本研究針對試劑盒提取的華根霉細(xì)胞總蛋白，進一步比較了pH 3～10線性與非線性IPG膠條的分離效果，其2-DE圖譜如圖3所示。可以看出，pH 3～10非線性IPG膠條的使用更加有利于蛋白的分離，蛋白點分布均勻，圖譜分辨率高(圖3(b))。

圖3 細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜pH梯度優(yōu)化Fig.3 Optimization of pH gradient on 2-DE maps of total protein

為驗證2-DE圖譜的重復(fù)性，采用上述建立的優(yōu)化方法，利用試劑盒提取總蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條，進行了3次生物學(xué)重復(fù)，獲得的3次重復(fù)結(jié)果如圖4。從結(jié)果來看，細(xì)胞總蛋白樣品的3次重復(fù)實驗獲得的2-DE圖譜蛋白分離效果均較好，分辨率較高。利用PDQuest 8.0.1軟件分析，細(xì)胞總蛋白重復(fù)樣品間的蛋白斑點匹配度可以達到87%，表明利用優(yōu)化后的實驗條件可以最終獲得分辨率高、重復(fù)性好的華根霉總蛋白2-DE圖譜，可用于其蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

圖4 華根霉總蛋白2-DE重復(fù)性驗證Fig.4 Repeatability of 2-DE maps on the total proteins extracted from Rhizopus chinesis

2.2 華根霉膜蛋白2-DE圖譜的建立

為了獲得更豐富的膜蛋白信息，針對華根霉膜蛋白，分別利用 ReadyPrepTMProtein Extraction Kit和Triton X-100兩種方法提取膜蛋白。但是該試劑盒未能實現(xiàn)華根霉膜蛋白的提取，由于該試劑盒主要適用于酵母、細(xì)菌及動植物組織，對于絲狀真菌華根霉可能并不適合，也可能由于本實驗菌株華根霉菌體細(xì)胞內(nèi)油脂含量比較高，試劑盒提取液無法在特定條件下分離膜蛋白。而采用Triton X-100提取得到了較好的膜蛋白樣品，可用于雙向電泳分析。

同樣比較了pH 3～10線性與非線性IPG膠條對于Triton X-100提取的膜蛋白雙向電泳的分離效果，結(jié)果如圖5。選用pH 3～10線性的IPG膠條時，蛋白點主要集中在pH 4～7區(qū)域范圍內(nèi)，影響了蛋白點的分離及膠圖的美觀。選用pH 3～10非線性的IPG膠條，蛋白點分布更加均勻，有利于蛋白的分離，獲得的圖譜更加清晰，分辨率較好。用PDQuest 8.0.1軟件分析，檢測到蛋白點增加了43.6%。因此，對于膜蛋白也采用非線性的IPG膠條進行分離。

為驗證華根霉膜蛋白2-DE圖譜的重復(fù)性，利用Triton X-100提取膜蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條的優(yōu)化方法，同樣進行了3次生物學(xué)重復(fù)，獲得的3次重復(fù)結(jié)果如圖6。從結(jié)果來看，膜蛋白樣品的3次重復(fù)實驗獲得的2-DE圖譜蛋白分離效果也均較好，分辨率較高。利用PDQuest 8.0.1軟件分析，膜蛋白重復(fù)樣品間的蛋白斑點匹配度高達94%，表明利用優(yōu)化后的實驗條件可以最終獲得分辨率高、重復(fù)性好的華根霉膜蛋白2-DE圖譜，可用于其蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

圖5 膜蛋白2-DE圖譜pH梯度優(yōu)化Fig.5 Optimization of pH gradient on 2-DE maps of membrane protein

2.3 華根霉細(xì)胞總蛋白與膜蛋白2-DE的相關(guān)性分析

由于試劑盒的方法提取的細(xì)胞總蛋白可能含有膜蛋白，本研究將試劑盒提取的細(xì)胞總蛋白樣品與膜蛋白樣品的2-DE圖譜進行了比較分析。利用PDQuest 8.0.1軟件比較分析結(jié)果顯示，細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜上共有蛋白點741個，膜蛋白2-DE圖譜上共有蛋白點274個，蛋白點匹配情況如圖7，說明用試劑盒提取細(xì)胞總蛋白樣品可以提取分離一定量的膜蛋白，但是相較于單獨提取的膜蛋白樣品，仍有約45.3%的膜蛋白無法體現(xiàn)在細(xì)胞總蛋白2-DE圖譜上。結(jié)果表明，試劑盒提取細(xì)胞總蛋白樣品除了大量的胞內(nèi)蛋白外，也包含部分膜蛋白;可以用于一般的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究;而本研究膜蛋白提取方法可以獲得較為豐富的華根霉膜蛋白，更適合于膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

圖6 華根霉膜蛋白2-DE重復(fù)性驗證Fig.6 Repeatability of 2-DE maps on the membrane proteins extracted from Rhizopus chinesis

圖7 細(xì)胞總蛋白與膜蛋白2-DE圖譜蛋白點匹配Fig.7 Protein points matching on 2-DE maps of total proteins and membrane proteins

3 結(jié)論

本研究針對絲狀真菌華根霉細(xì)胞總蛋白和膜蛋白，分別比較了不同蛋白樣品的提取方法，并通過IPG膠條的pH梯度優(yōu)化，獲得了可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的較理想的2-DE圖譜。分別采用ReadyPrepTMProtein Extraction Kit試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條;Triton X-100提取膜蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條，可獲得有效分離、較清晰、分辨度高的華根霉細(xì)胞總蛋白和膜蛋白2-DE圖譜。3次生物學(xué)重復(fù)實驗，細(xì)胞總蛋白重復(fù)樣品間和膜蛋白重復(fù)樣品間的蛋白斑點匹配度分別達到87%和94%，表明該方法重復(fù)性好。蛋白點匹配分析表明，利用ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取的細(xì)胞總蛋白用于雙向電泳可以分離得到一定量的膜蛋白，總蛋白點數(shù)優(yōu)于普通裂解液提取的細(xì)胞總蛋白，可以用于一次實驗同時獲得豐富胞內(nèi)蛋白及部分膜蛋白信息的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，且經(jīng)濟省時。而膜蛋白提取方法可以獲得較為豐富的華根霉膜蛋白，若想獲得更加全面的膜蛋白信息，這種方法更為適合。本研究為基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究華根霉及相關(guān)微生物生理代謝機制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］ Gibbs P A，Seviour R J，Schmid F.Growth of filamentous fungi in submerged culture:Problems and possible solutions［J］.Critical Reviews in Biotechnology，2000，20(1):17－48.

［2］ Dufosse L，F(xiàn)ouillaud M，Caro Y，et al.Filamentous fungi are large-scale producers of pigments and colorants for the food industry［J］.Current Opinion in Biotechnology，2014，26:56－61.

［3］ Hevekerl A，Kuenz A，Vorlop K D.Filamentous fungi in microtiter plates-an easy way to optimize itaconic acid production with Aspergillus terreus［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98(16):6 983 － 6 989.

［4］ Perez-Rodriguez N， Oliveira F， Perez-Bibbins B， et al.Optimization of xylanase production by Filamentous Fungi in solid-state fermentation and scale-up to horizontal tube bioreactor［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，173(3):803 －825.

［5］ SHI X Z，SHA Y，Kaminskyj S.Aspergillus nidulans hypA regulates morphogenesis through the secretion pathway［J］.Fungal Genetics and Biology，2004，41(1):75 －88.

［6］ 邵臣斌，朱華躍，蔣茹，等.絲狀真菌形態(tài)控制的分子機制研究［J］.食品科技，2013(7):20－23.

［7］ Bruneau J M，Magnin T，Tagat E，et al.Proteome analysis of Aspergillus fumigatus identifies glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins associated to the cell wall biosynthesis［J］.Electrophoresis，2001，22(13):2 812 － 2 823.

［8］ Kim Y，Nandakumar M P，Marten M R.Proteome map of Aspergillus nidulans during osmoadaptation［J］.Fungal Genetics and Biology，2007，44(9):886 － 895.

［9］ Oda K，Kakizono D，Yamada O，et al.Proteomic analysis of extracellular proteins from Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state culture conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(5):3 448 －3 457.

［10］ Ouyang H M，LUO Y M，ZHANG L，et al.Proteome analysis of Aspergillus fumigatus total membrane proteins identifies proteins associated with the glycoconjugates and cell wall biosynthesis using 2D LC-MS/MS［J］.Molecular Biotechnology，2010，46(3):317 －319.

［11］ Vodisch M，Scherlach K，Winkler R，et al.Analysis of the Aspergillus fumigatus proteome reveals metabolic changes and the activation of the pseurotin a biosynthesis gene cluster in response to hypoxia［J］.Journal of Proteome Research，2011，10(5):2 508 －2 524.

［12］ Knigge T，Letendre J，Monsinjon T.Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis:Considering the composition of biological material［J］.Proteomics，2013，13(21):3 106－3 108.

［13］ Roobol-Boza M，Dolby V，Doverskog M，et al.Membrane protein isolation by in situ solubilization，partitioning and affinity adsorption in aqueous two-phase systems-purification of the human type 1 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase［J］.Journal of Chromatography A，2004，1 043(2):217－223.

［14］ Bunai K，Yamane K.Effectiveness and limitation of twodimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives［J］.Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2005，815(1 －2):227 －236.

［15］ Griffiths L G，Choe L，Lee K H，et al.Protein extraction and 2-DE of water and lipid-soluble proteins from bovine pericardium，a low-cellularity tissue［J］.Electrophoresis，2008，29(22):4 508 －4 515.

［16］ Rabilloud T.Membrane proteins and proteomics:Love is possible，but so difficult［J］.Electrophoresis，2009，30(supplement 1):S174－S180.

［17］ TAN S，TAN H T，Chung M C M.Membrane proteins and membrane proteomics［J］.Proteomics，2008，8(19):3 924－3 932.

［18］ 孔令瓊，管政兵，張波，等.黃酒麥曲浸提液中宏蛋白質(zhì)組的制備［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(3):7－11.

［19］ 趙紹輝，周景文，堵國成，等.釀酒酵母蛋白質(zhì)雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2014(3):235－240.

［20］ ZHANG L，F(xiàn)ENG D Q，F(xiàn)ANG W X，et al.Comparative proteomic analysis of an Aspergillus fumigatus mutant deficient in glucosidase I(AfCwh41)［J］.Microbiology-Sgm，2009，155:2 157 －2 167.

［21］ Nandakumar M P，Marten M R.Comparison of lysis methods and preparation protocols for one-and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins［J］.Electrophoresis，2002，23(14):2 216 － 2 222.

［22］ 胡彬彬，林連兵，魏云林，等.一種高效的真菌總蛋白質(zhì)提取方法［J］.中國生物工程雜志，2013(9):53－58.

［23］ Jastorff A M，Haegler K，Maccarrone G，et al.Regulation of proteins mediating neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］.Proteomics Clinical Applications，2009，3(11):1 273 － 1 287.

［24］ BAO S J，GUO X Q，YU S Q，et al.Mycoplasma synoviae enolase is a plasminogen/fibronectin binding protein［J］.Bmc Veterinary Research，2014，10:223.

［25］ Kovach Z，Kaakoush N O，Lamb S，et al.Immunoreactive proteins of Campylobacter concisus，an emergent intestinal pathogen［J］.Fems Immunology and Medical Microbiology，2011，63(3):387 －396.

［26］ Hama S，Tamalampudi S，F(xiàn)ukumizu T，et al.Lipase localization in Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles for use as whole-cell biocatalysts in biodiesel-fuel production［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，101(4):328 －333.

［27］ TENG Y，XU Y，WANG D.Production and regulation of different lipase activities from Rhizopus chinensis in submerged fermentation by lipids［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2009，57(1 －4):292 －298.

［28］ XU Y，WANG D，MU X Q，et al.Biosynthesis of ethyl esters of short-chain fatty acids using whole-cell lipase from Rhizopus chinesis CCTCC M201021 in non-aqueous phase［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2002，18(1－3):29－37.

［29］ ZHAO S H，ZHAO X R，ZOU H J，et al.Comparative proteomic analysis of Saccharomyces cerevisiae under different nitrogen sources［J］.Journal of Proteomics，2014，101:102－112.

［30］ 葉妙水，鐘克亞，胡新文，等.雙向凝膠電泳的實驗操作及進展［J］.生物技術(shù)通報，2006(3):5－10.