大鼠深靜脈血栓形成模型建立及觀察

吳鵬 黃晨 馮惠崗 莊煒釗 唐郁寬 謝貞靜 郭惠莊 郭冬梅 時光 陳漢威

·基礎(chǔ)研究·

大鼠深靜脈血栓形成模型建立及觀察

吳鵬 黃晨 馮惠崗 莊煒釗 唐郁寬 謝貞靜 郭惠莊 郭冬梅 時光 陳漢威

目的 建立大鼠深靜脈血栓形成（DVT）模型，觀察實驗大鼠術(shù)前及術(shù)后不同時間凝血酶原時間、纖維蛋白原含量、D-二聚體含量及血栓長度的變化情況。方法 將30只SD大鼠用結(jié)扎阻斷下腔靜脈及其分支，并用微血管夾鉗夾損傷靜脈壁的方法誘導(dǎo)深靜脈血栓形成。于術(shù)前第1天及術(shù)后第1、4、7、10、14、21天采靜脈血檢測纖維蛋白原含量、D-二聚體含量及凝血酶原時間，并行血管造影觀察血栓及血管再通情況。結(jié)果 共23只大鼠深靜脈血栓模型制作成功，功率76.67%（23/30）。纖維蛋白原含量、凝血酶原時間及D-二聚體含量在術(shù)前與術(shù)后之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但術(shù)后不同時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后血栓長度在不同時間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 凝血酶原時間、纖維蛋白原及D-二聚體可作為是否有血栓形成的重要參考指標(biāo)，但在評價病情進(jìn)展及嚴(yán)重程度方面價值有限；血栓長度隨時間先增長，后又溶解，直至消失。

大鼠； 模型，動物； 纖維蛋白原； D-二聚體

靜脈血栓栓塞癥包括深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）和肺動脈栓塞（pulmonary thromboembolism，PTE），每年的發(fā)病率在1‰以上，是患病率及死亡率的重要原因[1]。1875年Cohnleim和Litten首次采用動物實驗證實DVT可導(dǎo)致肺動脈栓塞，奠定了通過動物實驗?zāi)Ｐ脱芯緿VT或PTE病理生理機(jī)制的基礎(chǔ)[2]。深靜脈血栓形成的復(fù)雜機(jī)制目前尚未充分明確，故制備出與人類深靜脈血栓形成相似的動物模型很困難，犬、豬等大動物的深靜脈交粗大，但在阻斷血流過程中，有一定的死亡率，且費用昂貴，重復(fù)性難[3-4]。目前最常用的實驗動物是大鼠和小鼠，我們用SD大鼠建立深靜脈血栓形成模型，對DVT的病理變化進(jìn)行觀察研究。

材料與方法

一、對象

選用清潔級SD大鼠，體重在200～250 g，由暨南大學(xué)動物實驗中學(xué)提供并飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級，溫度（23±20）℃，每天給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及水，自由攝食，每天定時清潔。

二、建立大鼠DVT模型

步驟：①術(shù)前禁食12 h，用0.3%戊巴比妥行腹腔注射麻醉（單位劑量0.15 ml/100 g），麻醉后取仰臥位，備皮、消毒、鋪巾。②取下腹部正中線作縱行切開，長3～4 cm，顯露腹腔，將部分腸管移出腹腔，用蘸有生理鹽水的濕紗布保護(hù)小腸。充分顯露后腹膜，腹主動脈緊貼在下腔靜脈（inferior vein cava，IVC），腹主動脈呈鮮紅色，IVC顏色較深，呈暗紅色。③鈍性分離IVC表面的腹后膜及結(jié)締組織，于左腎靜脈起始處往下分離IVC和腹主動脈。在IVC表面并行放置1條4號絲線，用5-0 Prolene縫合線同時一起結(jié)扎，并在結(jié)扎線下方上微血管夾，再緩慢抽出4號絲線，1 h后移開血管夾。④下腔靜脈處理完后，檢查腹腔有無出血，將腸管回納入腹腔，逐層關(guān)腹，再次進(jìn)行切口消毒。術(shù)后用暖燈保暖至大鼠清醒。

三、標(biāo)本采集及觀察

1.血液標(biāo)本采集：在術(shù)前及術(shù)后第1、4、7、10、14、21天，進(jìn)行眼眶靜脈叢采血。具體步驟：①對大鼠進(jìn)行麻醉后，左手拇、示兩指從背部較緊地握住大鼠的頸部，注意防止大鼠窒息。②當(dāng)取血時左手拇指及食指輕輕壓迫動物頸部兩側(cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持長頸（3～4 cm）硬質(zhì)玻璃滴管（毛細(xì)管內(nèi)徑0.5～1.0 mm），使采血器與鼠面成45°角，由眼內(nèi)角刺入，針頭斜面先向眼球，刺入后再旋轉(zhuǎn)180°使斜面對著眼眶后界。刺入深度4～5 mm。當(dāng)感到有阻力時即停止推進(jìn)，同時將針退出少許，血液能自然流入毛細(xì)管中，滴入采血器，每次采血約2 ml，立即移除毛細(xì)管。③將采集到的血液標(biāo)本1 h內(nèi)送檢，在轉(zhuǎn)速3500轉(zhuǎn)/分下離心15 min，采用凝固法檢測標(biāo)本中纖維蛋白原含量及凝血酶原時間，D-二聚體（D-dimer，DD）含量采用免疫比濁法檢測，所需試劑均由Siemens公司提供，使用Sysmex公司全自動凝血分析儀CS-5100進(jìn)行檢測。

2.下腔靜脈造影：采完血液標(biāo)本后，對大鼠進(jìn)行下腔靜脈造影。具體步驟：①用2 ml注射器（去針頭）抽吸1 ml生理鹽水，連接24G一次性靜脈留置針，大鼠尾部左右兩條靜脈相對比較容易穿刺，以大鼠尾巴下三分之一的位置適宜，用75%的乙醇棉球擦拭穿刺部位，使穿刺部位血管充盈及消毒。②進(jìn)針時左手食指和拇指固定大鼠的尾巴，讓大鼠的尾巴經(jīng)過拇指后向下彎曲，進(jìn)針點靠近拇指前端。針頭和血管成30°角，針尖斜面朝上，輕輕挑刺入皮膚后針頭立即和血管平行，可將針頭刺入血管多半，輕輕回抽針?biāo)?，看見有明顯的回血，正常情況下，推注的過程應(yīng)該沒有明顯阻力，血管也不會鼓起。③確定穿刺進(jìn)入尾靜脈，將針?biāo)ㄍ耆纬?，用膠布將針頭固定在大鼠尾巴上，將大鼠取仰臥位，四肢及尾巴固定在硬紙板上，在DSA機(jī)（GE INOVA3100）下進(jìn)行造影，留置針連接裝有對比劑（碘克沙醇320 g/L）的注射器，在X線照射下手推注射器，分別取正、側(cè)位進(jìn)行造影。觀察、測量并記錄下腔靜通暢情況、側(cè)支循環(huán)及血栓長度。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，DD、纖維蛋白原含量、凝血時間、血栓長度以±s表示，不同時間段之間的比較采用方差分析和SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、總體情況

23只大鼠存活，死亡7只（非解剖死亡），其中有4只大鼠在建模過程中，損傷大血管，出血死亡，另3只在實驗過程中因采血或過度麻醉死亡，最終總體制作成功率76.67%（23/30）；存活的23只經(jīng)DSA造影均可見血栓形成。

二、統(tǒng)計分析結(jié)果

1.描述性統(tǒng)計分析：凝血酶原時間均數(shù)值術(shù)后較術(shù)前減少，在第14、21天逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平；纖維蛋白原及DD含量術(shù)后較術(shù)前有升高，在第14、21天亦逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平；血栓長度變化表現(xiàn)出一定的時間規(guī)律，先增長，在第7天左右達(dá)到最長，后又減少，在第14天時明顯縮短，到第21天基本消失（見表1）。

2.方差分析：結(jié)果顯示各觀察指標(biāo)的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)不同時間段各觀察指標(biāo)間兩兩比較的SNK檢驗，按α=0.05水準(zhǔn)：①可認(rèn)為術(shù)前凝血酶原時間值高于術(shù)后各時間段的均值，但尚不能認(rèn)為術(shù)后各時間段凝血酶原時間的均數(shù)不同；②血栓長度在術(shù)后第7天最大，依次為術(shù)后第4天、術(shù)后第10天，術(shù)后第1天及第14天的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，最后為第21天；③術(shù)后第1、4、7、10天DD含量高于術(shù)前及術(shù)后第14、21天的，但術(shù)后第1、4、7、10天DD含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認(rèn)為術(shù)前及術(shù)后第14、21天DD含量不同；④術(shù)后第1天纖維蛋白原的含量達(dá)到最高，其次為術(shù)后第4、7、10、14天，最后是術(shù)后第21天及術(shù)前第1天，術(shù)后第1、4、7、10天纖維蛋白原的均數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后第4、7、10、14天纖維蛋白原均數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后第21天及術(shù)前第1天的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各觀察指標(biāo)在不同時間段的值（±s）

表1 各觀察指標(biāo)在不同時間段的值（±s）

觀察指標(biāo) 凝血酶原時間（s）纖維蛋白原含量（g/L）DD含量（μg/L）血栓長度（mm）術(shù)前第1天 11.15±1.27 1.44±0.25 30.00±11.34 —術(shù)后第1天 9.67±1.13 2.18±0.33 55.33±14.08 11.51±2.97術(shù)后第4天 9.69±0.76 2.08±0.36 58.00±18.59 21.54±3.44術(shù)后第7天 9.19±0.96 2.10±0.46 50.67±13.35 24.56±2.03術(shù)后第10天 9.95±1.28 2.02±0.50 55.33±15.06 14.88±3.45術(shù)后第14天 10.17±1.02 1.78±0.24 40.00±16.04 10.65±4.18術(shù)后第21天 10.27±1.05 1.50±0.22 29.33±11.00 1.27±0.71總體 10.01±1.20 1.87±0.44 45.52±18.08 12.06±9.06

表2 各觀察指標(biāo)方差分析表

討 論

本實驗在制作大鼠深靜脈血栓模型時，對大鼠造成較大的創(chuàng)傷，且結(jié)扎下腔靜脈造成血液流通不暢及損傷血管壁，機(jī)體很快啟動凝血機(jī)制，結(jié)扎約1 h后就能肉眼觀察到血栓形成。凝血酶原時間、纖維蛋白原及DD在大鼠深靜脈血栓制作前后均有明顯變化，但術(shù)后其各自變化規(guī)律與相應(yīng)時間段血栓長度的變化規(guī)律都不符，甚至每只大鼠的凝血酶原時間、纖維蛋白原及DD含量變化規(guī)律都不盡相同。可得出結(jié)論：凝血酶原時間、纖維蛋白原及DD含量的變化是判斷血栓形成的重要觀察指標(biāo)，但在評估血管栓塞病變范圍及程度特異性不高。近年來隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多的疾病被證明與纖維蛋白原和DD相關(guān)，肺栓塞、靜脈血栓、彌散性血管內(nèi)凝血障礙、感染、腫瘤及骨折等是均其升高的病因，導(dǎo)致纖維蛋白原和D-二聚體對于DVT的診斷特異性不高。有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示DD定量檢測結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)對于排除DVT具有較高的敏感性[5]。

纖維蛋白原一直以來被作為預(yù)測血栓和血栓形成的獨立危險因素。許多流行病學(xué)研究已證實，高纖維蛋白原水平與心血管事件的發(fā)生有明顯相關(guān)性[6]。纖維蛋白原是血漿中含量最高的凝血因子，在血液凝固和血小板聚集中均具有重要作用。纖維蛋白原在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白和不溶性降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)對血管平滑肌有刺激作用，可使血管平滑肌由動脈中層轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，并在內(nèi)膜增殖，從而啟動了血栓形成的過程；纖維蛋白原作為血液組成成分，其分子大且有聚合作用，是除紅細(xì)胞外決定血液黏度的第二重要因素。血漿纖維蛋白原水平增高，可以改變血液黏度和血液流變學(xué)指標(biāo)，尤其是血漿黏度，而血液流變學(xué)指標(biāo)和血漿黏度的改變又與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血栓形成等多種效應(yīng)有關(guān)[7]。

DD是已交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物中含有γ鍵的片段，它的生成或增高反映了凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，其血漿中的水平可代表體內(nèi)凝血酶的活性及纖維蛋白的生成情況，可作為體內(nèi)血栓形成的指標(biāo)之一[8]。DD含量可以定性地反映血栓形成后的溶栓效果，即定量檢測血漿D-二聚體水平可以間接明確溶栓治療的效果，對于診斷、篩選新產(chǎn)生的血栓和掌握停止DVT溶栓治療的時機(jī)具有重要的臨床指導(dǎo)意義[9]。

纖維蛋白原和DD是血液發(fā)生血栓及血栓前狀態(tài)的凝血及纖溶系統(tǒng)活性改變的分子標(biāo)志物，可反映體內(nèi)凝血和纖溶過程的變化，是血栓形成或溶解的標(biāo)志[10]。定期監(jiān)測兩者水平可以動態(tài)地反應(yīng)機(jī)體的高凝狀態(tài)程度，對于選擇臨床治療方案和患者溶栓治療的預(yù)后評估有重要意義。

本實驗所用的下腔靜脈血栓模型是最為常用、簡便的大鼠血栓模型，與人體的深靜脈血栓形成狀況存在較大差別。人體深靜脈血栓形成是一個全身性、系統(tǒng)性的復(fù)雜病變，形成的血栓基本很難自溶，且并發(fā)癥較多，而本實驗用的大鼠深靜脈血栓模型在術(shù)后第21天已基本完全自溶，其中機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 Huang W, Goldberg RJ, Anderson FA, et al. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: Worcester VTE Study（1985-2009）[J]. Am J Med, 2014，127(3):829-839.

2 Dalen JE. Pulmonary embolism：what have we learned since Virchow？ Natural history, pathophysiology, and diagnosis[J]. Chest,2002,122（4）:1440-1456.

3 Sood V, Luke C, Miller E, et al. Vein wall remodeling after deep vein thrombosis：differential effects of low molecular weight heparin and doxycycline[J]. Ann Vasc Surg, 2010,24（2）:233-241.

4 Dewyer NA, Sood V, Lynch EM, et al. Plasmin inhibition increases MMP-9 activity and decreases vein wall stiffness during venous thrombosis resolution[J]. J Surg Res, 2007,142（2）:233-241.

5 熊立凡，王鴻利.D-二聚體與靜脈血栓癥診斷-循證實驗診斷舉例[J].診斷學(xué)理論與實踐，2005,1（4）：75-78.

6 Danesh J, Collins R, Appleby P, et al. Association of fibrinogen, C-reactive protein，aibumin, or leukocyte count with coronary heart disease：meta-analyses of prospective studies[J]. JAMA，1998，279（18）：1477-1482.

7 熊長明.D-二聚體在深靜脈血栓形成和急性肺栓塞中的診斷價值[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2002，4（2）：104-105.

8 胡云建，陶鳳榮，王厚東，等.D-二聚體測定在肺栓塞診斷中的應(yīng)用價值[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2002，25（2）：95-97.

9 Joffe HV, Goldhaber SZ. Upper-extremity deep vein thrombosis[J]. Circulation，2006，106（14）：1874-1878.

10 Naito M. Effects of fbrinogen，fbrin and their degradation products on the behaviour of vascular smooth muscle cells[J]. Nippon Ronen Lgakkai Lasshi，2007,37（6）：458-463.

Establishment and observational studies of deep venous thrombosis in rats model

Chen Hanwei, Email: docterwei@sina.com

Objective To establish deep venous thrombosis (DVT) model in rats, and analyze the changes of prothrombin time, fbrinogen content, D-dimer content and thrombus length before and after operation. Methods All of 30 SD rats were ligatured and blocked the inferior vena cava and its branches, and injured vein wall by micro vessel clamp method to induce the formation of deep venous thrombosis. Venous blood were collected to detected the fbrinogen content, D-dimer content, and prothrombin time at 1 day before operation and postoperative 1, 4, 7, 10, 14, 21 days. The angiography performed to observe the thrombosis and blood vessel recanalization. Results A total of 23 deep venous thrombosis models were successfully produced, with a power of 76.67% (23/30). Prothrombin time, fbrinogen content and D-dimer content in the preoperative and postoperative were statistically signifcant, but the differences were not statistically signifcant between different time after operation. There were signifcant differences in the length of thrombus in different time. Conclusions Prothrombin time, fbrinogen content and D-dimer content can be used as important reference indexes in the formation of thrombosis, but in the evaluation of disease progression and severity of the value were limited. The thrombus length increased with time, then dissolved, and disappeared.

Rats； Model, animal； Fibrinogen； D-dimer

2014-7-4）

（本文編輯：黃強(qiáng)）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2015.02.009

511400 廣州市番禺中心醫(yī)院介入治療科

陳漢威，Email：docterwei@sina.com

Wu Peng*, Huang Chen,Feng Huigang, Zhuang Weizhao, Tang Yukuan, Xie Zhenjing, Guo Huizhuang, Guo Dongmei, Shi Guang, Chen Hanwei. *The First Clinical College of Jinan Univrsity, Guangzhou 510600, China

吳鵬，黃晨，馮惠崗，等.大鼠深靜脈血栓形成模型建立及觀察[J/CD].中華介入放射學(xué):電子雜志,2015, 3(2): 91-94.