樹(shù)鼩糞便細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

劉麗君,余柄廷,胡凝珠,孫曉梅,王 瑋,孫 靜,胡云章,李建芳

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118；3.河北大學(xué)生命學(xué)院，河北保定 071000）

樹(shù)鼩糞便細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

劉麗君1,2,余柄廷3,胡凝珠2,孫曉梅2,王 瑋2,孫 靜2,胡云章2,李建芳2

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118；3.河北大學(xué)生命學(xué)院，河北保定 071000）

目的 了解人工飼養(yǎng)樹(shù)鼩糞便菌群多樣性，為樹(shù)鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。方法 隨機(jī)采集10份樹(shù)鼩糞便樣品，利用有氧及厭氧培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，提取細(xì)菌基因組DNA后PCR擴(kuò)增16SrRNA基因并測(cè)序鑒定。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)從樹(shù)鼩糞便樣品中，經(jīng)有氧培養(yǎng)分離鑒定出25株、12種細(xì)菌，經(jīng)厭氧培養(yǎng)分離鑒定出25株、10種細(xì)菌，包括變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬。結(jié)論 樹(shù)鼩腸道好氧菌及厭氧菌具有豐富的種屬多樣性，普通變形桿菌群、費(fèi)格森埃希菌群和屎腸球菌群可能是樹(shù)鼩腸道的主要寄生菌群。

樹(shù)鼩；糞便細(xì)菌；有氧培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)；分離鑒定

樹(shù)鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）形態(tài)酷似松鼠，是種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類(lèi)的小型動(dòng)物，具有體型小，繁殖能力強(qiáng)，易馴養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)易得等優(yōu)點(diǎn)。研究表明樹(shù)鼩的許多分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)近似于人類(lèi)，新陳代謝與解剖結(jié)構(gòu)比嚙齒類(lèi)更接近于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，常用于替代或減少一些非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的使用。樹(shù)鼩在腫瘤學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)、免疫學(xué)等方面已有廣泛和深入的研究，并對(duì)多種人類(lèi)重要病毒易感，可作為重要人類(lèi)病毒的動(dòng)物模型［1]。

但由于以往研究所用的樹(shù)鼩多為野外捕獲的動(dòng)物，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)樹(shù)鼩標(biāo)準(zhǔn)化，使得有些結(jié)果判定出現(xiàn)困難，如在動(dòng)物感染率、感染維持時(shí)間、感染指標(biāo)檢測(cè)等方面的穩(wěn)定性和重復(fù)性存在不足，致使一些學(xué)者提出質(zhì)疑，很大程度上影響了研究的進(jìn)展［2]。

普通級(jí)樹(shù)鼩在人工繁育過(guò)程中，曾有病原微生物所致樹(shù)鼩爆發(fā)腹瀉少數(shù)致死的情況，因此對(duì)排便正常的樹(shù)鼩，糞便中好氧及厭氧細(xì)菌的分離鑒定及分析，可為樹(shù)鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)，對(duì)樹(shù)鼩的飼養(yǎng)繁殖和科學(xué)管理具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［3]。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

10只健康來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)鼩種質(zhì)資源中心人工繁育普通級(jí)種群，生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK（滇）2013-0001】，使用許可證【SYXK（滇）2013-0001】。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度 22℃ ～25℃，濕度40％ ～60％，每日明暗交替照明12 h每天分別給予自制蒸料和商品化膨化犬料各一次，飲用城市供應(yīng)的自來(lái)水。

1.2 設(shè)備與材料

Forma恒溫培養(yǎng)箱；BIO-RAD梯度PCR儀；蘇州凈化設(shè)備有限公司HT6029型超凈工作臺(tái)；其林貝爾儀器制造有限公司QL-901型漩渦混合器；恒溫?fù)u床；三菱密閉式厭氧培養(yǎng)盒；三菱厭氧產(chǎn)氣袋；三菱厭氧指示劑；OXOID LB和腦心浸出液培養(yǎng)基；Promega-Wizard基因組DNA純化試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 樹(shù)鼩糞便的收集：抓取并保定樹(shù)鼩，多數(shù)樹(shù)鼩在抓取過(guò)程中因緊張而主動(dòng)排出糞便，對(duì)無(wú)糞便者通過(guò)輕輕按摩其腹部使其排便，每只樹(shù)鼩采集豌豆粒大小新鮮糞便標(biāo)本。

1.3.2 糞便樣品的混懸稀釋

將糞便樣品混懸到無(wú)菌生理鹽水中后以10倍遞增梯度稀釋。

1.3.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

選取適合的稀釋樣品涂布LB瓊脂平板和腦心浸出液瓊脂平板，分別做有氧和厭氧培養(yǎng)分離單菌落。

1.3.4 擴(kuò)增16SrDNA片段

將分離到的單菌落接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增，用試劑盒抽提基因組 DNA，用細(xì)菌16SrRNA的通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′和 1492R 5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA片段。

1.3.5 載體構(gòu)建

將純化的16SrDNA片段構(gòu)建到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽(yáng)性克隆。

1.3.6 測(cè)序鑒定

將陽(yáng)性克隆送到英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司做DNA測(cè)序。將得到的堿基序列輸入 NCBI GenBank做blast序列比對(duì)分析確定分離得到細(xì)菌的種屬。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)從10只無(wú)腹瀉等癥狀的正常樹(shù)鼩的糞便中，有氧和厭氧培養(yǎng)分別分離鑒定出25株、12種和25株、10種細(xì)菌，對(duì)分離菌株進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，在1500 bp處均出現(xiàn)一條明亮的目的條帶，如圖1、圖2。將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中參考菌株16SrRNA，基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析比較，根據(jù)不同屬細(xì)菌16SrRNA基因同源性為70％～90％，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性大于99％的判定標(biāo)準(zhǔn)。有氧及厭氧培養(yǎng)分離到普通變形桿菌、糞腸球菌、費(fèi)格森埃希菌、屎腸球菌、弗氏志賀菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、殺鮭氣單胞菌、水生拉恩氏菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、巴黎鏈球菌、腸系膜明串珠菌、水生微小桿菌等與NCBIGenBank中相關(guān)參考菌株16SrRNA基因的核苷酸序列同源性均在99％ ～100％之間，從而確定分離到的純培養(yǎng)菌株的種屬。

2.2 細(xì)菌總檢出數(shù)及檢出率

樹(shù)鼩糞便經(jīng)有氧和厭氧分離鑒定，檢出變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬，包括普通變形桿菌、屎腸球菌、費(fèi)格森埃希菌、弗氏志賀菌、糞腸球菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、巴黎鏈球菌、水生拉恩氏菌、水生微小桿菌、腸系膜明串珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、殺鮭氣單胞菌共14種細(xì)菌，總檢出數(shù)及檢出率見(jiàn)表1。其中普通變形桿菌、屎腸球菌、費(fèi)格森埃希菌、弗氏志賀菌檢出率達(dá)到50％。

圖1 有氧培養(yǎng)分離細(xì)菌16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Note：M.DNA Marker DL2000；1-12.PCR products of16SrRNA.Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA which isolated bacterial strains by aerobic culture

圖2 厭氧培養(yǎng)分離細(xì)菌16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Note：M.DNA Marker DL2000；1-10.PCR products of16SrRNA.Fig.2 PCR amplification of16SrRNA which isolated bacterial strains by anaerobic culture

2.2.1 有氧培養(yǎng)分離鑒定結(jié)果

樹(shù)鼩糞便經(jīng)有氧培養(yǎng)分離鑒定得到的細(xì)菌主要有變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬，其中普通變形桿菌5株、糞腸球菌4株、費(fèi)格森埃希菌3株、屎腸球菌3株、弗氏志賀菌2株、索氏志賀氏菌2株、大腸埃希菌1株、金黃色葡萄球菌1株、殺鮭氣單胞菌1株、水生拉恩氏菌1株、土生拉烏爾菌1株、水生微小桿菌1株。

2.2.2 厭氧培養(yǎng)分離鑒定結(jié)果

樹(shù)鼩糞便經(jīng)厭氧分離鑒定得到的細(xì)菌主要有埃希菌屬、志賀菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬、氣單胞菌屬、明串珠菌屬、拉烏爾菌屬，其中費(fèi)格森埃希菌5株、屎腸球菌4株、弗氏志賀菌3株、索氏志賀氏菌3株、巴黎鏈球菌2株、糞腸球菌2株、普通變形桿菌2株、土生拉烏爾菌2株、腸系膜明串珠菌1株、殺鮭氣單胞菌1株。

3 討論

腸道正常菌群是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期歷史進(jìn)化在宿主內(nèi)形成的定植微生物群落，他們對(duì)宿主是有益的和必需的，在正常狀態(tài)下是無(wú)害的。種類(lèi)不同的腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相拮抗互相協(xié)同，在質(zhì)和量上形成一種動(dòng)態(tài)生物平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常樹(shù)鼩糞便菌群的多樣性，間接說(shuō)明樹(shù)鼩常態(tài)腸道寄生菌群的多樣性。

表1 培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果及檢出數(shù)與檢出率Tab.1 Identification results and detection number and detection rate of isolated bacterial strains.

在10只正常排便樹(shù)鼩的糞便樣品中，我們通過(guò)有氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)分離到 50株細(xì)菌，經(jīng)過(guò)16SrRNA的序列比對(duì)分析鑒定分離到細(xì)菌包含了變形桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、志賀菌屬、葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、拉恩氏菌屬、拉烏爾菌屬、微小桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬共11個(gè)屬，14種細(xì)菌。其中分離到的費(fèi)格森埃希菌、弗氏志賀菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、屎腸球菌、索氏志賀氏菌、土生拉烏爾菌、殺鮭氣單胞菌等為兼性厭氧菌，在有氧和厭氧培養(yǎng)過(guò)程中均能分離得到。

根據(jù)分離培養(yǎng)結(jié)果，普通變形桿菌群、費(fèi)格森埃希菌群和屎腸球菌群的檢出比例均達(dá)到60％，表明普通變形桿菌群、費(fèi)格森埃希菌群和屎腸球菌群為樹(shù)鼩優(yōu)勢(shì)菌群，且可能是樹(shù)鼩腸道的主要寄生菌群。這些優(yōu)勢(shì)菌群與樹(shù)鼩的飲食習(xí)慣、生活習(xí)性和生理代謝等密切相關(guān)。

腸球菌屬的屎腸球菌和糞腸球菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要正常菌群。糞腸球菌其能產(chǎn)生天然抗生素，有利于機(jī)體健康同時(shí)還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用，改善腸道微環(huán)境［4-5]。且有研究報(bào)道普通變形桿菌、費(fèi)格森埃希菌等屬于條件致病菌，可存在于健康動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，極易引起疾病的發(fā)生［6-8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)糞便樣品進(jìn)行完全厭氧培養(yǎng)，另外得到腸系膜明串珠菌和巴黎鏈球菌，已廣泛應(yīng)用于風(fēng)味劑、血漿代用品的腸系膜明串珠菌，證實(shí)其能產(chǎn)生大量有機(jī)酸、醇類(lèi)及各種氨基酸等代謝物，能拮抗致病菌，促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)［9]。巴黎鏈球菌又稱(chēng)嬰兒鏈球菌結(jié)腸亞種，是牛鏈球菌的一種。牛鏈球菌與結(jié)腸疾病有關(guān)［10]。到目前為止國(guó)內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)中，對(duì)于巴黎鏈球菌的研究非常稀少，而這種菌株只從少數(shù)的臨床血、尿樣品以及非臨床的糞便樣品中分離到，因此該菌株的生物學(xué)特性尚不清楚，有待開(kāi)展進(jìn)一步的研究［11-12]。

所有樹(shù)鼩在采樣時(shí)雖然糞便色澤有所差異，但數(shù)周來(lái)均無(wú)拉稀腹瀉癥狀，大便正常，而且外觀健康，精神活動(dòng)狀況良好，沒(méi)有治療用藥情況。因此，所檢出的普通變形桿菌、費(fèi)格森埃希菌、志賀氏菌、殺鮭氣單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等條件致病菌種［5-8，13]，可以初步判斷應(yīng)為常態(tài)寄生菌種，這些條件致病菌的檢測(cè)監(jiān)控對(duì)于實(shí)驗(yàn)樹(shù)鼩的健康管理、質(zhì)量控制、日常飼養(yǎng)管理、疾病預(yù)防工作和將來(lái)生物凈化樹(shù)鼩種群的建立和生產(chǎn)提供指導(dǎo)具有一定的意義。

邢進(jìn)、高家紅等［14-15]關(guān)于樹(shù)鼩腸道細(xì)菌的研究顯示，大腸桿菌菌群、葡萄球菌菌群及鏈球菌菌群的檢出率較高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大差異。分析可能原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品為樹(shù)鼩的糞便，與活體樹(shù)鼩的肛門(mén)內(nèi)取樣或剖殺樹(shù)鼩采集回盲部?jī)?nèi)容物的采樣不同，且本實(shí)驗(yàn)增加嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)，因而可分離獲得一些不常檢出的厭氧菌。

本實(shí)驗(yàn)以溫和方式采集樹(shù)鼩糞便樣品，可減少對(duì)樹(shù)鼩的驚嚇及避免不必要的損傷。由于16SrRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性、序列分析的重現(xiàn)性極高，應(yīng)用16SrRNA作為分子指標(biāo)，分類(lèi)鑒定細(xì)菌具有快速、微量、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)采用的分離培養(yǎng)方式是傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法，然而在人類(lèi)微生物群系研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)部位的不同，在人體中約有20％ ～60％的細(xì)菌不能培養(yǎng)［16]。且有些細(xì)菌在糞便中可能豐度較低，或培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)易遺漏，不易通過(guò)傳統(tǒng)方法分離，提示我們可利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)等對(duì)這些微生物進(jìn)行高通量測(cè)序鑒定［17]，以便更加全面的檢測(cè)樹(shù)鼩糞便的微生物群系，為樹(shù)鼩的正常飼養(yǎng)繁殖和微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

［1] 沈培清，鄭紅，劉汝文，等.中國(guó)樹(shù)鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究進(jìn)展和展望［J].動(dòng)物學(xué)研究，2011，01：109-114.

［2] 黃曉燕，徐娟，孫曉梅，等.樹(shù)鼩在人類(lèi)疾病動(dòng)物模型中應(yīng)用研究進(jìn)展［J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2013，02：59-64.

［3] 仝品芬，年朝琴，彭超，等.致樹(shù)鼩腹瀉的奇異變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2014，01：41-44.

［4] Malik R K，Montecalvo M A，Reale M R，et al.Epidemiology and control of vancomycin-resistant enterococci in a regional neonatal intensive care unit.［J].Pediatric Infectious Disease Journal，1999，18（4）：352-356.

［5] Hugas M，Garriga M，Aymerich M T.Functionalty of enterococci in meat products［J].International Journal of Food Microbiology，2003，88（2-3）：223-233.

［6] 陶元勇，孫銘艷，李建花，等.弗格森埃希菌的生物學(xué)特征研究與16SrRNA檢測(cè)［J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，（3）：229-232.

［7] Sullivan A，T02rnblom H，Lindberg G，et al.Themicro-flora of the small bowel in health and disease［J].Anaerobe，2003，9 （1）：11-14.

［8] Norin E.How normal isa“normal”flora in animalorman［J]？Anaerobe，2011，17（6）：431-432.

［9] 李文斌，宋敏麗，高榮琨.腸膜明串珠菌的研究和應(yīng)用進(jìn)展［J].食品工程，2006，（4）：3-4.

［10] 李仲興.牛鏈球菌群感染的研究進(jìn)展［J].臨床薈萃，2006，21 （24）：1802-1804.

［11] Vanhoutte T，Huys G，Brandt E，et al.Molecular monitoring and characterization of the faecal microbiota of healthy dogs during fructan supplementation.［J].Fems Microbiology Letters，2005，249（1）：65-71.

［12] 董銀蘋(píng)，崔生輝，李鳳琴，等.乳酸桿菌及嗜熱鏈球菌的種水平鑒定——16SrRNA基因PCR擴(kuò)增及序列分析［J].衛(wèi)生研究，2010，39（4）：454-458.

［13] 林如濤，周作勇，王小林，等.羊源殺鮭氣單胞菌16SrRNA基因的克隆測(cè)序及分析［J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，33（8）：46-51.

［14] 邢進(jìn)，馮育芳，付瑞，等.野生樹(shù)鼩可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌攜帶情況的調(diào)查［J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，03：34-38.

［15] 高家紅，江勤芳，羅志武，等.樹(shù)鼩正常腸道細(xì)菌的培養(yǎng)分離鑒定及其藥敏試驗(yàn)研究［J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，12：24 -26+34.

［16] Peterson J，Garges S，Giovanni M，et al.The NIH Human Microbiome Project［J].Genome Res.2009，19（12）：2317 -2323.

［17] 陳秀，張曉君，李沁元，等.454焦磷酸測(cè)序分析幾種哺乳動(dòng)物糞便細(xì)菌多樣性［J].微生物學(xué)報(bào)，2015，06：683-690.

Isolation，culture and identification of bacterial strains from tree shrews feces

LIU Li-jun，YU Bing-ting，HU Ning-zhu，SUN Xiao-mei，WANGWei，SUN Jing，HU Yun-zhang，LIJian-fang
（1.Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Kunming 650118，China；3.Hebei University，Hebei Baoding 071000，China）

Objective Study the fecal flora diversity of the tree shrew，to provide a basis data of fecal bacteria of feeding the tree shrew.M ethods Ten tree shrews were used in this study.The Stools of the animals were respectively cultured with oxygen and without oxygen to isolate the bacterial.Then the PCR-amplified 16S rRNA of the bacterial was sequenced and analyzed.Results 25 bacterial strains belonging to ten bacterial species were isolated by anaerobic incubation，and 25 bacterial strains belonging to twelve bacterial species were isolated by aerobic incubation.Proteus vulgaris，Enterococcus faecalis， Escherichia fergusonii， Enterococcus faecium， Shigella flexneri， Shigella sonnei，Staphylococcus aureus，Aeromonas salmonicida subsp.masoucida，Rahnella aquatilis，Exiguobacterium aquaticum，Raoultella terrigena，and Escherichia coliwere identified in this study.Conclusions There is a fecal flora diversity of the tree shrew，and the Proteus vulgaris，Escherichia fergusonii and Enterococcus faecium may be themajor parasitic flora.

Tree shrew；Faecal bacteria；Aerobic culture；Anaerobic culture；Isolation identification

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0064-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.015

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAI01B01）；云南省社會(huì)發(fā)展新藥專(zhuān)項(xiàng)（2013BC011）。

劉麗君（1990-），女，碩士生，專(zhuān)業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

李建芳（1982-），女，助理研究員，E-mail：jianfangli@126.com。

﹞2015-08-31

技術(shù)方法