大鼠高血流性肺動脈高壓模型建立及病理生理改變

趙科研，李紅巖，王輝山，佟昌慈，張玉彪，施 琳，侯明曉

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科，沈陽 110840；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍重癥(戰(zhàn)）創(chuàng)傷中心實驗室，沈陽 110840）

大鼠高血流性肺動脈高壓模型建立及病理生理改變

趙科研1，李紅巖1，王輝山1，佟昌慈2，張玉彪2，施 琳2，侯明曉1

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科，沈陽 110840；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍重癥(戰(zhàn)）創(chuàng)傷中心實驗室，沈陽 110840）

目的建立大鼠頸總動脈與頸外靜脈吻合高血流性肺動脈高壓模型。方法 健康雄性SD大鼠45只分為分流組、結(jié)扎組和假手術(shù)組(n=15）。12周后檢查大鼠一般狀態(tài)；超聲心動圖觀察心臟情況、心排量及分流通暢情況；右心導(dǎo)管檢查右心室收縮壓，抽血氣分析計算肺循環(huán)/體循環(huán)血流量比值(QP/Qs）；右心室肥厚指數(shù)；肺組織HE染色及彈力纖維EVG染色。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件，對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差驗分析。結(jié)果

各組體重增加未見明顯差異，吻合通暢率84.6％。分流組大鼠心臟明顯增大，與假手術(shù)組、結(jié)扎組相比心排量明顯增加［(309.8±33.1）mL/min·kg比(245.6±31.9）mL/min·kg，(240.8±30.9）mL/min·kg相比，P＜0.05］；分流組QP/Qs為2.16±0.38，右心室收縮壓增加至(35.8±4.9）mmHg。分流組右心室肥厚指數(shù)0.3263±0.0342，比其它兩組增加明顯。與假手術(shù)組相比，分流組肺動脈中膜厚度明顯增加［(22.3±1.7）％ 比(10.6±1.7）％，P＜0.05］。結(jié)論 大鼠頸總動脈與頸外靜脈吻合法可以建立良好的高肺血流肺動脈高壓模型。

高血壓，肺性；模型，動物；大鼠；超聲心動圖

肺動脈高壓(Pulmonary artery hyPertension，PAH）是難治性疾病，常晚期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后極差［1］。在先天性心臟病中常見，主要為左向右分流導(dǎo)致肺血流明顯增加，高血流和(或）高壓力導(dǎo)致內(nèi)皮細胞穩(wěn)定性破壞，從而導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，其嚴重程度影響著先心病患兒的治愈程度以及后期的生活質(zhì)量，高流量誘導(dǎo)的肺高壓患者具有明顯的圍手術(shù)期死亡率和心臟手術(shù)較低的長期存活率［2，3］。建立良好的PAH模型是研究PAH的發(fā)病機制及臨床治療的基礎(chǔ)。在大鼠實驗中，常采用腹主動脈腔靜脈穿刺分流法［4］，分流量及血流動力學(xué)檢測困難；本研究采用左側(cè)頸總動脈和頸外靜脈吻合方法建立模型，采用超聲、心導(dǎo)管及病理生理檢查證實。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

成年雄性SPrague Dawley大鼠45只，體重(180～250）g，周齡(6～8）周，購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心【SCXK(遼）2010-0001】，于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，使用合格證號【SYXK(軍）2012-0003）】，食物及水由動物實驗中心提供，確保不含會對本實驗結(jié)果引起干擾的成分。

1.2 主要儀器

全自動顯微鏡數(shù)碼攝像系統(tǒng)(OlymPus，日本），LEICA病理切片機(德國），多功能病理圖象分析儀(同濟），BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司），Vevo 2100成像系統(tǒng)(VisualSonics公司，加拿大），Vivid Dimension 7系統(tǒng)和 10 S-transducer Healthcare探頭(GE公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物的分組和模型建立：實驗大鼠隨機分為3組(每組n=15）：分流組、結(jié)扎組和假手術(shù)組。測量體重，記錄并麻醉，腹腔注射戊巴比妥25 mg/kg行全身麻醉，四肢及頭部固定于小手術(shù)臺面。頸部縱行切口，約1.5 cm，分離左頸外靜脈及左頸總動脈，骨骼化，6-0 Prolene線結(jié)扎遠心端，近心端無創(chuàng)血管夾鉗夾；生理鹽水沖洗近心端至無血栓，11 -0無創(chuàng)線間斷端端吻合，撤除血管夾，可發(fā)現(xiàn)頸外靜脈近心端立刻充盈膨起，出現(xiàn)同心率同樣的搏動，吻合通暢(圖1A）。術(shù)后腹膜下注射肝素25U (0.2 mL）抗凝，術(shù)前給予青霉素100 000 U預(yù)防感染。結(jié)扎組：充分游離左頸外靜脈及左頸總動脈，近遠端分別做結(jié)扎，并切斷，防止再通，不做吻合術(shù)；假手術(shù)組：單純分離兩支血管，不做吻合及結(jié)扎。12周后再次麻醉行血流動力學(xué)檢測時檢查血管吻合通暢率(圖1B）。飼養(yǎng)過程中注意觀察各組大鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、進食、活動、有無感染以及死亡情況。

1.3.2 超聲檢查：模型建立12周后，大鼠麻醉后先行超聲檢查，心臟超聲采用Vivid Dimension 7系統(tǒng)和10 S-transducer Healthcare探頭，觀察左、右室腔內(nèi)徑以及主動脈直徑(胸骨旁左室長軸）；計算心排量：脈沖DoPPler肺動脈血流在心底肺動脈長軸切面獲得，計算DoPPler信號心跳持續(xù)時間、平均測量5個連續(xù)心跳就能算出每博變化的平均值，每博容積通過主動脈直徑2×3.14×velocity time integral (VTI）/4，每博量乘以心率，因該分流過主動脈和肺動脈血流量基本一致，只是到全身的體循環(huán)流量較肺循環(huán)流量降低，可以用此法估算心排血量；吻合口血管超聲采用Vevo 2100成像系統(tǒng)，檢測測定分流口流速及通暢性。

1.3.3 右心導(dǎo)管檢查：12周后測定右心室收縮壓(right ventricular systolic Pressure，RVSP）動物再次麻醉：再次全身麻醉，右心PE微導(dǎo)管(自制）測右心室收縮壓(BL-420S系統(tǒng)，由右頸外靜脈切口插入，直至顯示屏上出現(xiàn)典型的心室壓力波形，說明進入右心室。右心室抽血做血氣分析；然后控制好導(dǎo)管，穩(wěn)定一段時間后，記錄壓力波形并保存，拔除測壓管。測壓完畢后，股靜脈、腹主動脈分別穿刺抽血各0.3 mL做血氣分析

1.3.4 組織病理學(xué)觀察：12周后心臟剪下測量心室質(zhì)量，計算右心室質(zhì)量與左心室加室間隔質(zhì)量比值。肺組織采用4％多聚甲醛溶液以20 cm H2O壓力充滿氣道，并浸泡固定進行病理學(xué)檢查。肺組織固定于中性甲醛溶液中48 h后取材，Leica自動組織脫水機內(nèi)進行組織脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片厚約4 μm，采用HE染色和彈力纖維染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織血管、肺泡。每個肺組織標(biāo)本取5支肺泡水平肺小動脈，彈力纖維染色圖片采用光鏡觀察，采集圖像后采用軟件分析，計算肺小動脈(每只動物20根，直徑在50～150 μm之間）的中膜厚度WT和血管的外徑ED。計算中膜厚度百分比：WT％=(2×WT/ED）×100％。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法：實驗結(jié)束后，將各自結(jié)果統(tǒng)計繪制表格，用±s來表示計量資料，采用SPSS 16.0將各組數(shù)據(jù)進行科學(xué)的統(tǒng)計和分析，采用單因素方差分析，P＜0.05時，實驗數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

分流組從麻醉到結(jié)束的平均為(58.4 ±12）min，結(jié)扎組手術(shù)操作時間較短，結(jié)扎兩血管平均用時約20 min為保證對照，結(jié)扎組及假手術(shù)組均等待到60 min左右。分流組死亡率為13.3％(2/15），結(jié)扎組死亡率為6.7％(1/15），假手術(shù)組無動物死亡。分流組大鼠1只死于頸總動脈血管夾脫落大出血死亡，一只術(shù)后2 d死亡(考慮吻合口出血）；結(jié)扎組1只死于頸總動脈損傷出血。死亡的大鼠排除于實驗。

圖1 左側(cè)頸總動脈與頸外靜脈吻合術(shù)后即刻和12周后顯微鏡下觀察Note.A：Immediately after anastomosis；B：Twelve weeks after anastomosis；LCCA：Left common carotid artery；LEJV：Left external jugular vein；Stoma：AnastomosisFig.1 MicroscoPic Performance immediately and twelve weeks after anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein

各組大鼠12周時13只有10只開始精神狀態(tài)差，活動減少，被毛松軟，體毛干枯，但未表現(xiàn)明顯體重下降，分流組體重增加(219.9±42.1）g，結(jié)扎組體重增加(227.0±37.2）g，假手術(shù)組體重增加(216.0±40.3）g，統(tǒng)計學(xué)計算未見明顯差異，無肢體偏癱等表現(xiàn)(表1）。

在分流術(shù)后12周，大鼠麻醉后沿原頸部切口解剖左側(cè)頸動靜脈及吻合口，周圍可見皮下及纖維組織粘連，動靜脈搏動明顯，與心跳頻率一致，頸總動脈未見管徑明顯變化，而與其吻合連接的頸外靜脈及頸靜脈明顯膨大，直徑可增粗到原直徑3～5倍(圖1B）。在分流組，1只大鼠分流不通暢，1只閉塞，通暢率為84.6％(11/13），這兩只排除于實驗，不進行統(tǒng)計分析及其它研究。

2.2 血流動力學(xué)檢測結(jié)果

BL-420 S系統(tǒng)測量大鼠右心室壓力，測得的RVSP數(shù)值結(jié)果：分流組的12周后右心室收縮壓力(35.8±4.9）mmHg明顯高于結(jié)扎組(25.6±2.9）mmHg和假手術(shù)組(25.1±3.7）mmHg，統(tǒng)計學(xué)差異明顯(P＜0.05），結(jié)扎組略高于假手術(shù)組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）(表1）。

根據(jù)靜脈血(下腔靜脈血）、動脈血(腹主動脈血）和混合靜脈血(右心室血）計算肺循環(huán)血流量(QP）和體循環(huán)血流量(Qs）比值：(動脈血飽和度 -靜脈血飽和度）/(動脈血飽和度 -混合靜脈血飽和度）。根據(jù)上述方法計算分流組QP/Qs為2.16± 0.38。

表1 各組大鼠一般數(shù)據(jù)Tab.1 The characteristics of rats in all grouPs

圖2 術(shù)后12周時超聲觀察Note.A：Sham；B：Ligation；C：Shunt；LV：Left ventricle；LVPW：Left ventricular Posterior wall；AO：Aorta；LA：Left atrium；PA：Pulmonary arteryFig.2 Ultrasonic aPPearance at 12 weeks after surgery

2.3 超聲檢查結(jié)果

分流12周時，心臟明顯增大，主要是左心室、右心室心腔明顯擴大，左心室合并肥厚(圖2）。根據(jù)心底肺動脈切長軸切面測得肺動脈瓣環(huán)直徑，連續(xù)五次心跳計算平均心率，每次心跳VTI，五次平均取平均數(shù)，計算CO。假手術(shù)組心排量(245.6±31.9）mL/min·kg與結(jié)扎組(240.8±30.9）mL/min·kg明顯低于分流組心排血量(309.8±33.1）mL/min·kg，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而假手術(shù)組和結(jié)扎組差異無統(tǒng)計學(xué)(表1）。

2.4 病理學(xué)檢測

分流12周時，右心室肥厚指數(shù)分流組(0.3263 ±0.0342）較假手術(shù)組(0.2507±0.0264）及結(jié)扎組(0.2620±0.0364）也明顯增加(表1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

HE染色結(jié)果：假手術(shù)組及結(jié)扎組肺動脈管壁菲薄，內(nèi)皮細胞扁平連續(xù)，細胞分布均勻，大小厚薄較一致；而分流組肺小動脈壁增厚伴玻璃樣變，管腔狹窄較重，肺組織較多炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，小血管壁正常結(jié)構(gòu)喪失，有纖維素樣滲出，管周有淋巴細胞浸潤，肺泡壁毛細血管淤血，肺間質(zhì)增厚(圖3，見文后彩插2）

彈力纖維染色(EVG染色）結(jié)扎組及假手術(shù)組肺動脈管壁菲薄，肺小動脈彈力纖維呈藍黑色(花邊樣），肌纖維呈黃色，膠原纖維呈紅色呈深棕色，大鼠在頸總動脈與頸外靜脈分流12周后出現(xiàn)中層增厚，管腔呈狹窄。中膜厚度百分比(22.3± 1.7）％，較結(jié)扎組(11.1±1.5）％和Sham組(10.6 ±1.7％）均明顯增加(P ＜0.01）(圖4，見文后彩插2）。

3 討論

分流法可以模擬先天性心臟病如動脈導(dǎo)管未閉、室間隔缺損、房間隔缺損等常伴有大量左向右血液分流［5］，由于肺血流量顯著增加，超過肺血管代償擴張限度，肺血管床容積相對不足，將直接導(dǎo)致肺動脈壓力增高，可用于先天性心臟病肺動脈高壓研究。對于小動物來說，制作房間隔、室間隔和動脈導(dǎo)管未閉的模型都非常困難且不穩(wěn)定，我們的實驗采用左側(cè)頸總動脈與頸外靜脈吻合建立分流，不進入胸腔及腹腔，創(chuàng)傷小，分流組大鼠的12周后右心室收縮壓力(35.8±4.9）mmHg明顯高于結(jié)扎組(25.6±2.9）mmHg和假手術(shù)組(25.1±3.7）mmHg，統(tǒng)計學(xué)差異明顯，肺組織病理形態(tài)出現(xiàn)了典型的病理變化，肺小動脈壁增厚，管腔狹窄較重，形成了明顯的肺動脈高壓，即高血流性肺動脈高壓。

頸總動脈到頸外靜脈分流模型特殊的病理生理：(1）分流處為大動脈分支與大靜脈吻合，分流的速度快，與房間隔缺損類似，單純靠高血流量導(dǎo)致肺動脈高壓，沒有像室間隔和動脈導(dǎo)管未閉一樣有直接的高壓力傳導(dǎo)到肺動脈，形成肺動脈高壓沒有那么快，QP/Qs為2.16±0.38，能夠?qū)е侣苑蝿用}高壓；(2）左心排量右心排量相等并同時增加：正是因為分流處位于主動脈瓣后和靜脈處，各心腔血流量均增加，左心及右心排量均明顯增加并相等；房間隔缺損左心室心排量因左心房的分流明顯降低，右心室的心排血量明顯增加；室間隔缺損左心室和右心室心排量明顯增加，右心房血流減少；動脈導(dǎo)管未閉左心排量明顯增加；因此該分流顯示心室質(zhì)量明顯增加，右心室與左心室和室間隔質(zhì)量比增加略緩慢，需要在長時間才能顯現(xiàn)；(3）與外周的動靜脈瘺病理相似，但因為是大動脈及大靜脈的分流，靠近心臟近所以導(dǎo)致心臟和肺的變化會較動靜脈瘺快。我們以前的研究采用野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓，在3～4周便可以形成明顯的肺動脈高壓(47.2±10.5）mmHg［6］，主要為肺動脈毒性損傷所致，分流模型則較好的模擬的高血流導(dǎo)致的肺高壓。

心排量及肺體循環(huán)血流量比例計算。對于本實驗，大鼠的心排量采用特殊的方法計算，采用通過肺動脈瓣血流積分×肺動脈瓣環(huán)面積×心率，是非常好的方法，能夠評估出心排血量，因為大鼠心率快，且受呼吸影響，采用二維法或SimPson法難以準(zhǔn)確計算；大鼠肺循環(huán)體循環(huán)血流比采用動脈、靜脈及混合靜脈血氧飽和度含量檢測，較準(zhǔn)確估算QP/Qs。

本實驗通過動靜脈吻合方法建立小動物分流模型通暢率高，與傳統(tǒng)的穿刺法及導(dǎo)管結(jié)扎法相比方法確實，可重復(fù)性好；該法從理論上就比穿刺法好，分流組13只有11只吻合通暢，通暢率84.7％，分流血流經(jīng)主動脈分流到頸外靜脈到左前腔靜脈，最后到右心房、右心室，分流的驅(qū)動力較房間隔缺損大，導(dǎo)致頸靜脈明顯增粗，直徑可達正常時的3～5倍。穿刺法一般多采用下腔靜脈-腹主動脈［7］，血管直徑1mm左右，采用穿刺針從下腔靜脈側(cè)向腹主動脈穿過，形成兩者之間的瘺，采用生物膠進行封閉，我們嘗試過，失敗之處主要以下幾點：(1）易出血，靜脈入口、出口及動脈入口難于止血；(2）局部易形成大血腫；(3）瘺口大小不易控制、會變化，分流量不好控制；采用導(dǎo)管法，即多采用自制導(dǎo)管，將兩端楔入血管結(jié)扎［8］，小動脈處外有導(dǎo)管限制，從理論上講不如直接吻合通暢率高。

另外，對于左側(cè)頸總動脈結(jié)扎對大鼠的影響，從我們的觀察來看，大鼠沒有肢體僵直、打轉(zhuǎn)或偏癱，體重和存活率與正常大鼠相似，這與其它研究觀察相似。對兔和大鼠來說，無論結(jié)扎左側(cè)，還是右側(cè)頸總動脈，均不會影響正常生存，與正常動物相比，其生長狀態(tài)沒有差異，這就意味著這兩類動物的大腦基底動脈環(huán)顯然存在著良好的交通吻合。雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，僅靠兩條椎動脈供血，已遠遠不能滿足腦供血［9］。至于大鼠的行為功能可能還是有所影響，我們沒有進行進一步的研究，但對大鼠的心血管血流動力學(xué)和病理生理影響小，這與其它研究相似［10］。

我們首次采用大鼠左側(cè)頸總動脈吻合頸外建立高肺血流動物模型，并且詳細測量討論該模型病理生理，對于先心病高肺血流PAH研究具有重要意義。

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Establishment and pathophysiological changes of a rat model of increased blood flow-induced pulmonary arterial hypertension by anastomosis of the
left common carotid artery to left external jugular vein

ZHAO Ke-yan1，LI Hong-yan1，WANG Hui-shan1，TONG Chang-ci2，ZHANG Yu-biao2，SHI lin2，HOU Ming-xiao1
(1.DePartment of Cardiovascular Surgery，General HosPital of Shenyang Military District，Shenyang 110840，China；2.Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma，PLA，Shenyang 110840）

Objective To establish a rat model of increased blood flow-induced Pulmonary arterial hyPertension generated by anastomosis of the left common carotid artery to left external jugular vein.Methods 45 male SD rats were divided into three grouPs：the shunt grouP，the ligation grouP and the sham grouP.At twelve weeks after the Procedure，the general status of the rats was observed.Heart conditions，cardiac outPut and shunt Patency were measured by echocardiograPhy.Right ventricular systolic Pressure(RVSP）and QP/Qs were checked by catheterization.Right ventricular hyPertroPhy index(RVHI）was calculated and lung tissues were examined by Pathology using hematoxylin-eosin and elastin Van Gieson staining.All data were analyzed statistically by one-way ANOVA test using SPSS 16.0.Results There was no significant difference in body weight gains between the grouPs.The Patency rate of shunt was 84.6％.The heart was enlarged in the grouP shunt.Cardiac outPut increased significantly in the shunt grouP than that in the other two grouPs［(309.8±33.1）mL/min·kg vs.(245.6±31.9）mL/min·kg，(240.8±30.9）mL/min·kg，resPectively，P＜0.05］.In the shunt grouP QP/Qs was 2.16±0.38 and RVSP increased to(35.8±4.9）mmHg，RVHI was 0.3263± 0.0342，significantly higher than that of the other grouPs.The Pulmonary arteriolar wall was evidently thickened in contrast to that in the sham grouP［(22.3±1.7）％vs.(10.6±1.7）％，P＜0.05）.Conclusions Anastomosis of the left common carotid artery to left external jugular vein can successfully establish Pulmonary arterial hyPertension model induced by high blood flow in rats.

HyPertension，Pulmonary artery；Animal model；Rat；EchocardiograPhy

R-33；R541.5 < class="emphasis_bold">【文獻標(biāo)識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0033-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.007

遼寧省科技計劃資助項目(編號：2012225014）；中國博士后科研基金(編號：2013M542471）。

趙科研(1975-），男，研究方向：瓣膜病及肺動脈高壓的治療。E-mail：zhaokeyan0088@163.com.

侯明曉(1963-），男，研究方向：危重病診療及心血管外科。E-mail：houmx188@163.com。

2015-07-25