固氮紅細(xì)菌（Rhodobacter azotoformans）多樣化色素蛋白復(fù)合體分離純化

岳慧英，李凱，趙春貴，楊素萍

（華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021）

紫細(xì)菌能高效完成光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化，將光能轉(zhuǎn)換為生物體可利用的化學(xué)能，同時能夠進(jìn)行與光合磷酸化相偶聯(lián)的生物放氫，是闡明光合作用機(jī)理、光合產(chǎn)氫放氫以及光電轉(zhuǎn)化機(jī)理的良好模型［1－3］。紫細(xì)菌執(zhí)行光合作用功能的光合元件是由整合在光合內(nèi)膜上排列規(guī)則的蛋白多肽非共價結(jié)合色素輔基構(gòu)成，主要是由光反應(yīng)中心（RC）、核心捕光復(fù)合體（LH1）和外周捕光復(fù)合體（LH2）3種類型的色素蛋白復(fù)合體（PPC）組成。其中，LH1和LH2主要進(jìn)行光能的吸收和傳遞，RC則主要完成光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。自Blastochloris viridis RC的三維晶體結(jié)構(gòu)［4］成功解析以來，對來自不同種屬PPC的分離純化及其結(jié)構(gòu)與功能研究一直是國際關(guān)注熱點［5］。

RC與LH1通常以1∶1的比率緊密相連，LH2不直接與RC相連，它只通過LH1傳遞能量給RC。與RC-LH1不同，LH2的數(shù)目和光譜類型具有較強的環(huán)境依賴性。LH2整體結(jié)構(gòu)為8－9個αβ異二聚體組成的空心圓柱體，每個αβ異二聚體非共價結(jié)合3個細(xì)菌葉綠素（BChl）分子和1個類胡蘿卜素（Car）分子［6］。LH2中BChl與αβ異二聚體特定的氨基酸殘基相互作用，形成B800和B850兩種耦合程度不同的激子環(huán)，其特征吸收峰分別約在800和850 nm，這些特征峰是判定LH2類型的重要指標(biāo)［6］。在不同種屬間甚至同一菌株中，LH2 B800和B850特征光譜的峰位和相對強度也有所不同，例如，高光培養(yǎng)時，Rhodopseudomonas（Rps.）palustris LH2特征吸收峰為803和857 nm，A803／A857≈0.80－0.90，低光時則顯示800和850 nm 特征峰，A800／A850≈2［7］；Chromatium vinosuim LH2的特征吸收峰為803和857 nm，A803／A857≈1［8］；2 000 lux光照時Rps.acidophila LH2 A803／A857≈0.85，400 lux時則 A803／A857≈1［9］。紅細(xì)菌屬如Rhodobacter（Rba.）sphaeroides和Rba.capsulatus LH2特征吸收峰為798和848 nm，在不同報道中A798／A848比值為0.4—0.8［9］。LH2特征吸收峰的差異可歸因于αβ異二聚體堆積疏密程度的不同［10］。

αβ異二聚體由puc BA基因編碼，不同種屬間，由于αβ異二聚體不同，LH2特征吸收峰將產(chǎn)生明顯差異，即使在同一菌株的基因組中往往存在多個不同的pucBA基因，不同pucBA基因表達(dá)的αβ異二聚組裝成LH2，由于LH2中αβ異二聚組成不同，也將導(dǎo)致B800和B850吸收光譜變化［7］，從理論上分析，即使在同一菌株中，由于LH2αβ異二聚體組成的差異，將產(chǎn)生多種光譜差異的LH2。目前已有在不同光照條件下從同一菌株獲得不同光譜類型LH2（典型LH2和LH3或LH4）的報道，但未見同一培養(yǎng)條件下從同一菌株中獲得B800－B850吸光度比值不同的LH2的報道。本文以固氮紅細(xì)菌（Rba.azotoformans）R7菌株為實驗材料，采用硫酸銨鹽析和蔗糖密度梯度離心結(jié)合離子交換層析兩種方法分離PPC，在不同的鹽析梯度下獲得了不同光譜類型的LH2組分，在不同的蔗糖密度梯度下獲得了2種光譜一致的LH2，以期為進(jìn)一步研究不同光譜類型LH2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

固氮紅細(xì)菌R7菌株，16S r RNA序列GenBank登錄號EU604757，本實驗室分離鑒定保存。

紫外可見分光光度計（UV-3200，MAPADA）；自動蛋白核酸純化儀（?KTA，Amersham Biosciences）；超速冷凍離心機(jī)（Beckman，Amerca）；臺式高速離心機(jī)（5417R，Eppendorf）；十二烷基二甲基胺氧化物（LDAO，F(xiàn)luka）；DEAE-纖維素52（DEAE-52，Whatman）。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基的配制和細(xì)菌的光照厭氧培養(yǎng)參照文獻(xiàn).［3］進(jìn)行。于30℃和3 000 lux條件下光照厭氧培養(yǎng)。

1.3 菌體破壁及膜蛋白增溶

離心收集菌體，用p H 8.0 10 mmol／L Tris-HCl緩沖液洗滌3次，稱其濕重。按每g濕菌體5 m L緩沖液的比例懸浮細(xì)胞，4.1 kpsi壓力破碎5次，向上述破碎后混合液中直接加入終濃度為1%LDAO和0.1 mol／L NaCl，4℃增溶膜蛋白2 h，12 000 r／min離心20 min收集增溶上清液。

1.4 鹽析結(jié)合層析分離純化PPC

硫酸銨鹽析參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行，向增溶上清液中加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)到30%，4℃緩慢攪30 min，靜置30 min，12 000 g離心20 min，收集沉淀并溶解于含有0.1%LDAO的10 mmol／L Tris-HCl緩沖液（p H8.0，TL）中，得到0－30%鹽析組分。上清液再經(jīng)50%、60%和80%硫酸銨分級分離，得到30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分。各鹽析組分經(jīng)透析和離心后，進(jìn)行全波長吸收光譜掃描。根據(jù)吸收光譜判斷0－30%鹽析組分和80%硫酸銨鹽析后上清中PPC相對含量較少，棄去。分別將30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分過濾，并上樣于DEAE-52柱，于4℃下層析，用TL緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，收集洗脫液并進(jìn)行光譜測定。

1.5 蔗糖密度梯度離心結(jié)合層析分離純化PPC

將增溶上清液置于10%－60%（w／w）蔗糖密度梯度，100 000 g離心2 h（Beckman SW-28轉(zhuǎn)子）。收集著色較深的條帶，超濾去蔗糖，離心，過濾，上樣于DEAE-52柱，于4℃下層析，方法同上。

1.6 光譜測定

用光程1 cm石英比色杯，于紫外可見分光光度計進(jìn)行光譜掃描，掃描波長范圍為200～1 000 nm。

Fig.1 Absorption spectra of intact cells（a），wallbreaking treated cells（b）and LDAO solubilization（c）圖1 活細(xì)胞（a）、破細(xì)胞壁處理的懸液（b）和增溶處理的上清（c）的吸收光譜

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體破壁及膜蛋白增溶

活細(xì)胞、破細(xì)胞壁處理以及LDAO增溶破壁細(xì)胞懸液上清液的吸收光譜見圖1。結(jié)果表明：活細(xì)胞含有380、447、476、508、591、802、852和875 nm 波長特征吸收峰的物質(zhì)。破壁處理后，約280 nm的蛋白峰顯現(xiàn)出來，其中447、476和508 nm 為 Car吸收峰，380、591、802、852和875 nm為BChl a的特征吸收峰。LDAO增溶處理后，各色素吸收峰均明顯增強，位于近紅外區(qū)的BChl a Qy帶吸收峰顯著升高，且發(fā)生1～2 nm的藍(lán)移，875 nm肩峰消失，表明PPC與內(nèi)質(zhì)膜分離，并且在該過程中LH1遭到0.1%LDAO的破壞［12］。

2.2 PPC分離純化

Fig.2 （A－C）Absorption spectra of the PPC components prepared by ammonium sulfate fractionation（up side）and elution profile during DEAE-52 ion-exchange chromatography（down side）.（D）absorption spectra of the purified PPC圖2 （A－C）分別為30%－50%、50%－60%和60%－80%硫酸銨鹽析分離組分的吸收光譜（上欄）和相應(yīng)的DEAE-52陰離子交換層析洗脫曲線（下欄）。（D）為各DEAE－52洗脫組分的吸收光譜

圖2為增溶上清經(jīng)30%－80%飽和硫酸銨分級分離所得各鹽析組分的吸收光譜。30%－50%鹽析組分的特征吸收峰位于～276、380、450、480、511、590、690、760、798和848 nm，其中276 nm為蛋白質(zhì)吸收峰，450、480和511 nm為球形烯Car吸收峰，380和590 nm分別為BChl a soret和Qx特征峰，760 nm為光反應(yīng)中心脫鎂細(xì)菌葉綠素a的Qy特征峰，798和848 nm為BChl a的Qy特征峰，光反應(yīng)中心的特殊對BChl a、輔助BChl a和LH2 BChl a的Qy特征峰均位于此處。結(jié)果表明30%－50%鹽析組分為RC和LH2的混合物。50%－60%鹽析組分與前者相比，少了690 nm BChl a特征峰和760 nm脫鎂細(xì)菌葉綠素a特征峰，表明該鹽析組分中主要是LH2。與前面兩者相比，60%－80%鹽析組分中，Car吸收峰發(fā)生了變化，BChl a Qy特征峰表明該分離組分以LH2為主。綜上所述，硫酸銨分級分離對PPC起到了初步分離的作用。

將各分離組分進(jìn)行DEAE－52柱層析，對應(yīng)洗脫曲線見圖2 30%－50%鹽析組分在0.1～0.15 mol L、0.15～0.2 mol／L和0.2～0.25 mol／L NaCl梯度下獲得3個洗脫組分，分別命名為P1、P2和P3。50%－60%鹽析組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P4洗脫組分。60%－80%鹽析組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P5洗脫組分。

增溶上清在蔗糖密度梯度中明顯分為2個條帶，分別位于20%－30%蔗糖層和50%－60%蔗糖層。20%－30%蔗糖層PPC組分的特征吸收峰主要位于271、380、450、480、511、590、798和848 nm（圖3A），而50%－60%蔗糖層PPC組分的特征吸收峰與前者明顯的差異在于出現(xiàn)690和760 nm吸收峰（圖3B）。將粗分離組分進(jìn)行DEAE-52柱層析，洗脫曲線見圖3。20%－30%蔗糖層PPC組分在0.15～0.2 mol／L NaCl梯度下獲得P6洗脫組分。50%－60%蔗糖層PPC組分在0.15～0.2和0.2～0.25 mol／LNaCl梯度下分別獲得P7和P8洗脫組分。

Fig.3 （A）and（B）absorption spectra of the PPC components distributed on sucrose density gradient（up side）and elution profile during DEAE-52 ion-exchange chromatography（down side）.（C）absorption spectra of the purified PPC圖3 （A）和（B）分別為20%－30%和50%－60%蔗糖層中PPC組分的吸收光譜（上欄）和相應(yīng)的DEAE－52陰離子交換層析洗脫曲線（下欄）。（C）為各DEAE－52分離組分的吸收光譜

2.3 純化組分的回收率

用吸收光譜檢測分離純化過程中蛋白質(zhì)和PPC特征吸收峰的變化，分別以O(shè)D270和OD850表示總蛋白和PPC的相對含量，計算分離過程中各純化PPC組分的回收率，結(jié)果見表1和表2。結(jié)果表明，30%－50%、50%－60%和60%－80%鹽析組分分別約占PPC總量的36.7%、5.5%和21.3%。經(jīng)DEAE離子交換層析獲得的5個PPC組分中P2和P5是優(yōu)勢組分，P1相對含量最少（表1）。增溶上清經(jīng)蔗糖密度梯度離心處理，位于20%－30%蔗糖層和50%－60%蔗糖層的PPC組分分別約占PPC總量的62.6%和29.5%。與硫酸銨鹽析不同，經(jīng)DEAE離子交換層析后可獲得P6、P7、P8 3個PPC組分，其中P6是優(yōu)勢組分，P8相對含量最少（表2）。

表1 硫酸銨鹽析結(jié)合離子交換層析分離純化PPC各組分的回收率Table 1 Recovery of protein and PPC during purification process by combination ammonium sulfate fractionation with ion exchange chromatography

2.4 純化PPC的光譜特征

圖2D和3C分別顯示了兩種分離方法制備的PPC的吸收光譜，P2、P4、P5、P6和P7具有典型的BChl 380 nm Soret帶、590 nm Qx帶、798和848 nm Qy帶吸收峰，以及典型的451、479和511 nm球形烯系Car吸收峰，與文獻(xiàn)中［13］報道的典型LH 2吸收光譜相似。P1在423nm具有一個額外的吸收峰，為不同于P2的LH2。P2、P4、P5、P6和P7洗脫組分的LH2中A798／A848比值分別為0.54、0.72、0.77、0.63和0.64，表明硫酸銨鹽析獲得3種不同光譜類型的LH2。蔗糖密度梯度離心獲得的P6和P7組分為光譜特征類似的LH2。P3和P8不同于LH2，其近紅外區(qū)呈現(xiàn)760、800和853 nm三指峰特征，另外還有380和600 nm BChla吸收峰，448、475和508 nm Car吸收峰，表明P3和P8為RC復(fù)合體，但峰位與文獻(xiàn)報道有細(xì)微差別［14－15］，可能由菌株差異造成。RC吸收光譜中蛋白質(zhì)吸光度要明顯強于BChla，因此，表1和2顯示30%－50%鹽析組分和50%－60%蔗糖密度層中PPC純化倍數(shù)較低是由于含有RC所致。

表2 蔗糖密度梯度離心結(jié)合離子交換層析分離純化PPC各組分的回收率Table 2 Recovery of protein and PPC during purification process by combination sucrose densitygradient centrifugation with ion exchange chromatography

3 討論

蔗糖密度梯度離心結(jié)合離子交換層析法可以獲得2種類型的色素蛋白復(fù)合體，RC（P8）和1種LH2（P6和P7，A798／A848約為0.63），相對含量分別為57.1%和2.5%。而硫酸銨鹽析結(jié)合離子交換層析法除了RC外，分離到3種具有不同 A798／A848比值的 LH2，A798／A848分別為0.54（P2）、0.72（P4）和0.77（P5），其中P2為優(yōu)勢組分。而且還能夠富集分離到1種具有423 nm吸收峰的LH2（P1），約占PPC總量的0.9%。

大量研究表明，LH2特征光譜差異多與αβ的不同相關(guān)。在Rps.palustris、Allochromatiumvinosum和Phaeospirillummolischianum等菌株中，不同多拷貝pucBA表達(dá)的αβ多肽結(jié)合形成LH2，導(dǎo)致產(chǎn)生不同光譜類型的LH2［7，16，8］。雖然固氮紅細(xì)菌的全基因組尚未測序，本文分離到不同光譜類型LH2表明該菌株基因組中存在多個編碼LH2αβ多肽的基因（pucBA）。

根據(jù)吸收光譜判斷分級分離起到了粗分離效果，分別將3個鹽析組分經(jīng)DEAE－52陰離子交換層析，于相同的NaCl梯度（0.15～0.2 mol／L）獲得3種不同光譜特征的LH2，其特征吸收峰均在798和848 nm，而其相對強度存在差異，這種差異和各自鹽析組分的特征光譜對應(yīng)。鹽析方法與被分離蛋白質(zhì)的表面電荷相關(guān)，由此推斷，P2、P4和P5 3種LH2存在表面電荷差異，用硫酸銨分級分離可以將其分離。另外，鹽析適用于大量樣品的處理，因此本文從固氮紅細(xì)菌中分離到含量較低的具有423 nm吸收峰的LH2（P1）。蔗糖密度梯度離心主要是憑借重力或離心力場的作用，將PPC按比重分層分離，在50%－60%蔗糖層也分離到LH2，是由于部分LH2隨著RC沉降。DEAE－52進(jìn)一步層析蔗糖密度梯度離心后分離組分只獲得1種光譜類型LH2。綜合2種分離純化結(jié)果，P2、P4和P5 3種LH2比重相近，蔗糖密度梯度離心結(jié)合DEAE離子交換層析沒有將其分離，只獲得一種光譜類型的LH2。目前不同多拷貝puc基因表達(dá)的LH2性質(zhì)非常相似，因此，將其分離仍是難點。本文通過設(shè)置硫酸銨鹽析梯度，從而實現(xiàn)了對不同光譜類型LH2的分離。

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